Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra

1. Faculdade de Medicina daUniversidade de Coimbra Mestrado Integrado em Medicina – Bioquímica I Seminário Orientado nº3 Ana Sousa Filipa Sousa Filipa Carvalho Filipa Sotero Filipa Reis Ana Lopes Ana Moreira Ana Augusto Filipa Figueiredo MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS 7-10-2009

2. Objectivos propostos: Analisar diferentes métodos para extracção de lípidos em amostras biológicas; Discutir diferentes métodos de análise de lípidos, incluindo a sua identificação; Explicar exemplos do estudo de lípidos para o diagnóstico em Medicina.

3. Breve noção sobre a bioquímica dos lípidos

4. EXTRACÇÃO DE LÍPIDOS Aspectos a ter em conta: • As características dos lípidos facilitam a separação de proteínas e açúcares; • A polaridade dos grupos químicos do lípido condiciona a polaridade do solvente; • lípidos com grupos polares são mais solúveis em álcoois do que em hexano. • Pode ser necessário quebrar ligações com outros componentes da molécula. Preparação das amostras para extracção: • Evitar as condições oxidantes no armazenamento (oxigénio, luz e temperatura); • Pré-secagem; • Moagem; • Hidrólise ácida.

5. Métodos de extracção de lípidos COM SOLVENTES • Extracção contínua: Método de Goldfish • Extracção semicontínua: Método de Soxhlet • Extracção descontínua: Método de Mojonnier e Método de Roese-Gottlib • Extracção de alta pressão: • Extracção acelerada com solventes • Extracção com fluidos supercríticos • Método de Bligh-Dyer e Método Reedet al. • éter etílico; • éter de petróleo; • hexano; • pentano; • clorofórmio; • acetona; • benzeno. Solventes mais comuns

6. Métodos de extracção de lípidos COM SOLVENTES Lípidos apolares solventes apolares (hexano, éteres) Lípidos polares misturas de solventes polares e apolares (metanol, clorofórmio) • Características ideais do solvente: • - Grande poder solvente; • - Não solubilizar proteínas, aminoácidos e hidratos de carbono; • - Evaporar rapidamente; • - Penetrar rapidamente nas partículas da amostra; • Não inflamável; • - Atóxico; • - Baixo custo; • - Não higroscópico (sem capacidade de reter água).

7. Métodos de extracção de lípidos com solventes A QUENTE • Utiliza refluxo de solvente para extracção; • Processo de extracção contínuo, logo, mais rápido; • Pode ser utilizado somente com amostras sólidas. • Vantagem: utiliza menos solvente e é mais rápido, pois, sendo contínuo, faz com que a amostra esteja permanentemente em contacto com o solvente. • Desvantagem: o contacto do solvente muito quente com a amostra pode levar à degradação da gordura. MÉTODO DE GOLDFISH Adaptado de Inar Castro, 2006 (Fac. Ciências Farm, Universidade São Paulo). % Lípidos = peso final balão – peso inicial balão x 100 peso amostra

8. Métodos de extracção de lípidos com solventes A QUENTE • Utiliza refluxo de solvente para extracção; • Processo de extracção intermitente; • Só pode ser utilizado com amostras sólidas; • A quantidade de solvente é maior para que o volume total seja suficiente para atingir o sifão do equipamento. • Vantagem: a amostra não fica em contacto directo com o solvente em ebulição, evitando-se a decomposição dos lípidos. • Desvantagem: possível saturação do solvente o que dificulta a extracção. MÉTODO DE SOXHLET giangarloscientific.com Legenda: (1)recipiente do solvente (2)recipiente de extracção (3)funil (4)condensador

9. Métodos de extracção de lípidos com solventes A FRIO MÉTODO DE BLIGH-DYER • Utiliza uma mistura a frio de três solventes: clorofórmio, metanol e água; • As amostras são avaliadas quanto ao nível de peroxidação e perfil de ácidos gordos; • Pode ser usada para qualquer tipo de amostra (seca ou húmida). Procedimento: Adaptado de Inar Castro, 2006 (Fac. Ciências Farm, Universidade São Paulo).

10. Métodos de extracção de lípidos SEM SOLVENTES Métodos de Babcock e de Gerber:  Digestão com ácido  Adição de álcool isoamílico (Gerber)  Colocação em recipiente de medida  Centrifugação e leitura Métodos instrumentais:  Ressonância magnética nuclear Medida da constante dieléctrica Espectroscopia de infravermelho  Medidas de densidade Medidas da velocidade do som  Método colorimétrico (reacção com o ácido hidroxâmico)

11. Métodos de extracção de lípidos SEM SOLVENTES MÉTODO DE GERBER • Apenas utilizado em leite e produtos lácteos. Estrutura do leiteEmulsão Filme proteico x1 Digestão proteica(libertar gordura) Ácido sulfúrico / álcool isoamílico x1000 Centrifugação directa no butirómetro a 71ºC Leitura final no butirómetro X10000 Leitura final no butirómetro

12. Métodos de identificação de lípidos Método físico-químico de separação baseado na migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interacções entre uma fase móvel e outra estacionária. Crom. gás-sólido ou de partição Crom. gás-líquido ou de absorção Crom. Gasosa de alta resolução • Cromatografia Gasosa • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência • Cromatografia em Camada Fina Cienciamao.if.usp.br

13. Importância da extracção de lípidos • Permite fazer a análise do teor lipídico de amostras biológicas, incluindo alimentos: • Padrões de identificação e rotulagem; • Investigação e diagnóstico. Hortibrasil.org.br

14. Importância da extracção de lípidos ESTUDO DOS LÍPIDOS E DIAGNÓSTICO EM MEDICINA • Hipo ou Hipertiroidismoa glândula da tiróide exerce controlo sobra a concentração de lípidos no plasma sanguíneo. Hipotiroidismo – lipaemia; Hipertiroidismo – lipopenia; • Doenças do sistema nervoso centrala desregulação do metabolismo dos lípidos pode influenciar distúrbios neurológicos: bipolaridade e esquizofrenia, e doenças neurodegenerativas: Alzheimer, Parkinson e NiemannPick; • Fibrose cística relacionada com dislipidemiahipertrigliceridemia, diminuição da ácidos gordos essencias (hipocolesterolemia normalmente) ; • Hipercolesterolemia familiardeficiência do metabolismo lipídico, nomeadamente o transporte e metabolismo do colesterol .

15. Referências bibliográficas Suporte escrito NELSON, David L.. COX, Michael M.. Lehninger: Principles of Biochemistry. Nova Iorque: W. H. Freeman and Company. Fifth Edition. MURRAY, Robert K.. GRANNER, Daryl K. etall.(1998). Bioquímica de Harper. México: El Manual Moderno. 11ª edição. SILVA, Ana. (2008). Notas de campo. Disciplina de Bioquímica. (Não publicado) Suporte informático http://www.uac.pt/~barreto/bqm_prat/prot04aExt_lipidos_introd.pdf http://www.gipescado.com.br/arquivos/met_fis-qui_ial/cap25.pdf http://www.sitebiomedico.hpg.ig.com.br/proteinas.htm http://ojs.c3sl.ufpr.br/ojs2/index.php/alimentos/article/view/7489/5359 http://www.aapsj.org/view.asp?art=aapsj080236