Projets de thérapie cellulaire et génique : études précliniques et conduite de l’essai clinique

1. Projets de thérapie cellulaire et génique : études précliniques et conduite de l’essai clinique Fabian GROSS Chef de projet Biothérapies CIC BT/DRI CHU de Toulouse

2. Développement d’un médicament Laboratoire de recherche et promoteur Approches in vitro et in vivo relevant de la pathologie visée par le protocole clinique. Développement du « médicament expérimental » • Laboratoire de recherche • Intérêt d’une cible ou d’une approche expérimentale (in vitro et in vivo)

3. Etudes Pré Cliniques : le contexte Déterminent la valeur thérapeutique et les investigations chez l’homme (paramètres cliniques à surveiller) • Etudes Pharmacologiques : activité du produit • Etudes Pharmacocinétiques : devenir et intéractions du médicament dans l’organisme (homme ou animal) • Etudes Toxicologiques : effets adverses d’un produit • Toxicité aigüe • Toxicologie chronique • Toxicologie de la fonction de reproduction • Etudes de mutagénèse • Etudes de cancérogénèse

4. Etudes Pré cliniques : Stratégie Adoptée • Préambule : - ProduitouMédicamentidentiqueou comparable a celuide l’essaiclinique • Méthodes et techniques validées (in vitro et in vivo) • Principales lignes directives : International Conference of Harmonization • Nature des études selon le stade de développement du produit : ICH M3 (CPMP/ICH/286/95) • Produits biotechnologiques: ICH S6 (CPMP/ICH/302/95) • Application: Thérapie anticancéreuse : ICH S9 (CPMP/SWP/997/96)

5. Dossier de Pharmacologie Etudes pharmacocinétiques Données sur l’absorption, le métabolisme, la distribution, la fixation des protéines plasmatiques, l’excrétion et le bilan de radioactivité Si étude in vitro => matériel d’origine humaine Etudes pharmacologiques Pharmacodynamie Données in vivo et in vitro de l’activité du produit liée ou non a l’effet thérapeutique attendu Pharmacologie de sécurité Effets sur système respiratoire, nerveux et cardiovasculaire => voir études de toxicologie

6. La toxicologie conditionne la première dose à administrer à l’homme Seuil de tolérance Aucun effet : pharmacologique (NOEL : No EffectLevel) Secondaire (NOAEL : No Adverse EffectLevel) Seuil d’efficacité MABEL (Minimal AnticipatedBiologicalEffectLevel ) Dose Maximale Tolérée MTD

7. Toxicologie Générale Etudes BPL (directives 2004/10/CE et guidelines applicablesEMEA Guideline EMEA/CHMP/410869/2006 du 31/07/2007) • Objectifs : • Détermination de la 1ère dose injectée à l’homme (Phase 1) • Identification des effets adverses et d’organes cibles (NOEL et NOAEL) • Reversibilité des effets adverses • Relation effets du produit et de ses métabolites • Influence du sexe, de la dose, du temps d’exposition ou d’autres facteurs • Design : • Groupes : Control (véhicule seul), faible dose (NOEL), forte dose (MTD) et dose moyenne • Animaux : 2 espèces (un non rongeur), ♂ et ♀ • Durée : 24h à 2 ans • Voie et régime administration : IV et voiecliniqueenvisagée

8. Etude de Biodistribution et de Toxicité par administration unique • Injection : • IV puis voie clinique, suivi pendant 2 à 5 semaines • Escalade de doses selon un processus séquentiel • Suivi : • Observations cliniques sur les 1ères 24h puis 1 à 2 fois par semaine • Analyses biologiques et biochimiques • Sacrifice et Autopsie : • Examens anatomo-pathologiques d’une 12aine d’organes • Etude du potentiel immunotoxique • Dosage du médicament expérimental ou des cellules dans les organes

9. Exemple du CYL-02 • InjectionIV du CYL-02 (1er lot pré-GMP) chez la souris de 250µg/kg à 7500µg/kg • Suivi : Observations cliniques et analyses bio et bioch (sang, urine) • Autopsie : Examens anatomo-pathologiques de 12 organes + tumeur • Dosage du transgène (organes, sang et urines) • Définition de la NOAEL à 1500µg/kg

10. Quantification des transgènes par qPCR • Répartition de la positivité sexe/organes/doses confondus • Biodistribution : Poumon, foie, rein, muscle et gonades • Pic de détection à 6h post injection

11. Toxicité et biodistribution par voie « clinique » • Conduit sur un 2ème modèle animal • OBJECTIFS • Calculer la première dose à administrer à l’homme suivant le mode d’administration prévu en clinique • METHODES • Modèle animal pathologie ou du modèle d’étude si non disponible • Injection du ME par la voie clinique, suivi des animaux sur les jours suivant et 1 à 2 fois par semaines (biologie et biochimie). • Traitement de l’animal par les traitements concomitants de l’étude • Entre 2 et 5 semaines, sacrifice des animaux et prélèvement des organes pour anapath et dosage du médicament expérimental

12. Toxicité intratumorale du CYL-02 4 groupes : Glucosé 5% (véhicule) avec ou sans traitement Gemcitabine CYL-02 (900µg/kg) avec ou sans traitement Gemcitabine J9, 11 et 13 Injections intrapéritonéales de Gemcitabine (80 mg/kg). J15 Sacrifice des animaux et prélèvement des organes. J0 queue du pancréas par mini-laparotomie gauche (allogreffe orthotopique) J7 Contrôle de l’évolution de la tumeur par laparotomie médiane exploratrice. Injection et suivi des animaux. Aucune létalité dans l’ensemble des groupes ayant reçu le CYL-02 seul ou associé à la gemcitabine.

13. Résultats de la biodistribution après injection intra tumorale Biodistribution : • Présence du transgène dans la tumeur 8 jours après une injection intra-tumorale. • « CYL-02 + gemcitabine », faible positivité au niveau rénale et intestinal alors que positif au niveau splénique Suivi pondéral : • Aucune anomalie pondérale et clinique dans le groupe CYL-02, • Amaigrissement significatif (15% en moyenne) avec la gemcitabine, • Aucune différence significative entre « gemcitabine seule » versus  « CYL-02 + gemcitabine». Examen anatomopathologique macroscopique : Aucune lésion pancréatique, péritonéale, ou hépatique 1 200 1 000 % de progression 800 600 400 200 - 50 ± 3 % 0 Témoins gemzar PTG PTG + gemzar

14. Etude de Toxicité à dose répétéedu Cyl-02 • OBJECTIFS • Simulation du protocole proposé chez l’homme • Accumulation • Sensibilisation • Cerner la Pharmacologie de Sécurité • Calculer la première dose à administrer à l’homme Calcul de la 1ère dose injectable à l’homme HED (Dose équivalente chez l’Homme) = NOAEL (Animal)/ Facteur de sécurité/ fact clearance (Homme/Animal) Soit : 900µg/Kg/60/7,4 = 2µg/kg Poids moyen d’un patient ACP de 63kg => 125µg

15. Exempled’étudede biodistribution • Injection de 2.106 CSM dansl’organeconsidérésur le modèle animal Nude de la pathologievisée par l’étudecliniquesur des 10x♂ et 10x♀: vehiculeseul (CTRL –) et CSM • Surveillance des signescliniques des animaux (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine • Sacrifice à 3 semaines (toxicitéaigüe) et 12 semaines (toxicitéchronique), observation macroscopiquesur8organes (ganglions, foie, cerveau, reins, rate, peau, gonades et poumons) + organeinjecté • Résultat : Evolution du poids, morbidité, mortalité et signes de toxicité, anatomopathologie • Recherche de cellules humaines par qPCR (ALU) Aucune altération des organes Aucune cellule humaine à 3 et 12 semaines

16. Génotoxicité OBJECTIFS : Recherche de toute modification du matériel génétique induite par le ME Recherche d’une potentialité mutagène MODALITE : Etudes normalisées in vitro et in vivo, comprenant : Test de mutation génique in vitro sur bactéries (test de Ames) Test d’aberrations chromosomiques in vitro sur cellules de mammifères Optionnel : Test d’aberration chromosomique in vivo sur cellules hématopoïétiques de rongeur (test du micro noyau) Thérapie Génique : Mutagénèse insertionnelle des vecteurs viraux Thérapie Cellulaire : Tumorigénicité des cultures cellulaires

17. Exempled’étudede tumorogénicité • Injectionintramusculaireou sous cutanée chez la souris Nude (5 animaux/grpe) de 10.106 CSM : HT29 (CTRL+) ; véhiculeseul (CTRL –) et CSM • Surveillance des signescliniques des animaux (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine • Mesure des nodules 1 a 2 fois par semaine pendant 12 semaines • Sacrifice à 90 J et observation macroscopiquesur le site d’injection et 6 organes (en général : ganglions, foie, cerveau, reins, rate et poumons) • Si apparition de tumeurs, qPCR pour recherche de cellules humaines (ALU) • Résultats : Suivides animaux, poids, anatomopathologie et volume des tumeurs Résorption au point d’injection en 3 à 6 jours Pas de développement de tumeur Aucune altération des organes à 90J

18. Développement d’un médicament Laboratoire de recherche et promoteur Approches in vitro et in vivo relevant de la pathologie visée par le protocole clinique. Développement du « médicament expérimental » • Laboratoire de recherche • Intérêt d’une cible ou d’une approche expérimentale (in vitro et in vivo) Promoteur Protocole clinique sur des volontaires (sains ou patients) suivant des modalités d’inclusion et de suivi prédéfinies

19. Documents spécifiques à la thérapie génique : Ces documents sont a fournir par le promoteur lors de la demande d’Autorisation d’Essais Clinique (AEC) faite à l’ANSM et au HCB en plus des documents communs. · CERFA n° 12536*02 : agrément des locaux de recherche clinique en fonction du classement de l’OGM établit par le HCB. Décret n°93-773 du 27 mars 1993 et arrêté du 27 décembre 1994. · Annexe 2 : Principes applicables a l’évaluation du risque pour l’environnement décrit en termes généraux l'objectif à atteindre, les éléments à prendre en considération et les principes généraux ainsi que la méthodologie à suivre pour effectuer l'évaluation des risques pour l'environnement. Directive 2001/18/CE du 12 mars 2001. · Annexe 3A : Informations devant figurer dans la notification concernant la dissémination des OGM autres que les plantes supérieurs. Directive 2001/18/CE du 12 mars 2001. · Formulaire de synthèse de la notification concernant la dissémination volontaire d’OGM dans l’environnement à d’autres fins que leur mise sur la marché. Directive 2001/18/CE du 12 mars 2001. · Fiche d’information destinée au Public présente les buts et les utilisations prévues de la dissémination, la description synthétique et les méthodes de surveillance. Cette fiche d'information permet de procéder à une consultation du public sur cette dissémination et doit donc préciser les modalités de cette consultation et la date limite de réponse de 30 jours après sa publication sur le site internet de l’ANSM. Directive 2001/18/CE du 12 mars 2001. Remarque : la fiche d’information destinée au Public est différente de la notice d’information aux patients et ne la remplace en aucun cas. Documents spécifiques à la TG • Demande de classement initial et d’agrément CERFA 1674*02 Intégrer dans la demande l’utilisation pour essai clinique (addendum demande initiale) • Demande d’agrément des sites hospitaliers CERFA 12536*02 • Confinement doit être en adéquation avec le classement de l’OGM. • Une demande d’agrément d’utilisation confinée d’OGM par site (pharmacie, chambre hospitalière, laboratoire, local d’administration…). • numéro de dossier identique à celui du classement établit initialement par le HCB. • Annexe 2 : Principes applicables a l’évaluation du risque pour l’environnement. • Annexe 3A : Informations devant figurer dans la notification concernant la dissémination des OGM autres que les plantes supérieurs. • Formulaire de synthèse de la notification concernant la dissémination volontaire d’OGM dans l’environnement à d’autres fins que leur mise sur la marché. • Fiche d’information destinée au Public : date limite de réponse de 30 jours après sa publication sur le site internet de l’ANSM

20. Circuit du médicament • Sérologies patient (HIV 1&2, HTLV 1&2, HBC et HCV, Syphilis) • Autorisation du lieu de prélèvement (bloc opératoire, anesthésie et praticien) • Cahier navette Prélèvement de TA Ponction de MO Autorisation de site

21. Circuit du médicament Congélation ou Mise en culture Prélèvement de TA Ponction de MO • Transport avec respect des T° (ambiant, froid ou congelé) et des délais • Règlementation transport matières vivantes (directive européenne 2004/23/CE) Autorisation de site Société spécialisée et autorisée

22. Circuit du médicament Autorisation de production Congélation ou Mise en culture Expansion cellulaire ou transfert de gène Prélèvement de TA Ponction de MO Autorisation de site Société spécialisée et autorisée Cellules : SA Libération, congélation de la SA • Etablissement autorisé (établissement pharmaceutique ou non, classement pour OGM) • Contrôles in process (stérilité) • Délivrance d’un certificat de conformité

23. Circuit du médicament Autorisation de production Congélation ou Mise en culture Expansion cellulaire ou transfert de gène Prélèvement de TA Ponction de MO Autorisation de site Société spécialisée et autorisée Cellules : SA • Préparation pharmaceutique, stockage, décongélation, mise en forme, dispensation +/- confinement (double ou triple emballage) • Retour et destruction des UT, pb de l’inactivation des OGM : • solides a autoclaver (20 mn à 121°C) • liquides a neutraliser à la Javel (12h 2% final extemporané) Libération, congélation de la SA Préparation et dispensation pharmaceutique Mise en forme SA = PF

24. Circuit du médicament Autorisation de production Congélation ou Mise en culture Expansion cellulaire ou transfert de gène Prélèvement de TA Ponction de MO Autorisation de site Société spécialisée et autorisée Cellules : SA Libération, congélation de la SA Préparation de type pharmaceutique Mise en forme SA = PF Injection au volontaire

25. Conclusions • Produit grade recherche : • Preuve de concept et compréhension du mode d’action (Pharmacologie) • Développement et validation des techniques : caractérisation, identité, activité et fonctionnalité • Test in vivo : validation du modèle animal, efficacité et effets secondaires (pré toxicologie) • Produit grade Pré-GMP : • Pharmacologie essentiellement in vitro sinon a intégrer aux études de toxicologie in vivo • Tumorogénicité des MTI de TC et TG ex vivo, mutagénèse insertionnelle en TG • Biodistribution des vecteurs et des cellules • Toxicologie des vecteurs ou du transgène • Produit grade Clinique : • Circuit du médicament : confinement, délivrance, stabilité courte • Circuit du patient : prélèvement, injection, hospitalisation • Suivi des patients : effets adverses, confinement, fluides biologiques, destruction