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L’utilisation de la PCR en clinique. DES Médecine Interne-Maladies Infectieuses Dr Hector Rodriguez-Villalobos Service de Microbiologie. Hôpital Erasme-ULB. Définition et principe général. Le principe de cette technique fait appel à 3 éléments:

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L’utilisation de la PCR en clinique


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    Presentation Transcript
    1. L’utilisation de la PCR en clinique DES Médecine Interne-Maladies Infectieuses Dr Hector Rodriguez-Villalobos Service de Microbiologie. Hôpital Erasme-ULB

    2. Définition et principe général • Le principe de cette technique fait appel à 3 éléments: • Un ADN bicat chauffé au-dessus d’une certain température se sépare • Après chauffage le refroidissement permet une nouvelle hybridation entre séquences complémentaires • Les ADN polymérases sont des enzymes capables de recopier un brin d’ADN en s’appuyant sur un fragment complémentaire préalablement hybridé http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

    3. PCR: Principe et conditions • Imaginée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel dès 1993), • Essor considérable à partir de la commercialisation (vers 1988), d'une ADN polymérase résistante aux températures élevées (la Taq polymérase), qui permet une automatisation de la technique. • Il s'agit de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. • Chaque réaction met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3’ pointent l'une vers l'autre. Les amorces ou «primers» en anglais définissent alors, en la bornant, la séquence à amplifier. • L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes, au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle. http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

    4. PCR: "chercher une aiguille dans une meule de foin" ? • Abréviation de l’expression anglaise Polymerase Chain Reaction ou Réaction en Chaîne par Polymérase • À partir d’un échantillon complexe et peu abondant (par ex. une goutte de sang), la PCR permet multiplier spécifiquement le segment d'ADN d'intérêt (aussi appelé ADN cible) • L'ordre de grandeur est du million de copies en quelques heures. (généralement suffisant pour une utilisation ultérieure). http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

    5. PCR: Principe et conditions http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

    6. PCR: Principe et conditionsPremier cycle: dénaturation Séquence cible   A cette température, les liaisons faibles qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN. http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

    7. PCR: Principe et conditionsPremier cycle: Hybridation (annelage) • L'hybridation des amorces sur l'ADN repose sur le principe de l'appariement des bases complémentaires. • Le choix de la température d'hybridation est calculée en fonction de la longueur et de la séquence des amorces. • La température d'hybridation estinférieure à la température de dénaturation. http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

    8. PCR: Principe et conditionsPremier cycle: élongation • Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ à la polymérisation du brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. • par ajout successif des désoxyribonucléotides (présents dans le mélange en large excès). Chaque base ajoutée est complémentaire de la base correspondante du brin matrice. • La copie de l'ADN initial génère des copies plus longues que souhaité. http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

    9. Fin du cinquième cycle et cycles suivants….. ADN cible augmente de forme exponentielle • A chaque fois, la quantité d'ADN double dans le tube. • De façon théorique, en partant de 2 brins d'ADN initiaux • on obtiens 4 segments d'ADN à la fin du premier cycle • 8 à la fin du second, 16 à la fin du troisième • et jusqu'à 2 à la puissance n après n cycles ... • soit plus d'un million de copies en une vingtaine de cycles ! http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/

    10. 1 2 3 4 5 6 7 8 1114 900 692 501 404 320 242 PCR: Principe et conditions

    11. Détection et analyse du produit de réaction • Analyse sur gel d’agarose • Détection par un système de type ELISA • Séquençage directe • DNA Microarrays (micro chips) • Hybridation spécifique (Line probe assays LipAs) • Real-time PCR

    12. Microarrays (Chips)

    13. Types de PCR • RT-PCR • Utilisation d’une « reverse transcryptase » avant de la PCR permet de détecter cibles ARN (RNA virus, RNA ribosomale, mRNA) • Quantification de virus VIH et VHC: « charge virale » • Meningoencephalites par entérovirus • Dengue, virus Hantan, SARS, metapneumovirus • Bactériologie: plus de corrélation de mRNA avec la présence d’organismes viables • NASBA et TMA

    14. Types de PCR • PCR- MULTIPLEX • Utilisation de plusieurs paires d’amorces dans la même réaction • Permet de détecter plusieurs cibles (pathogènes) dans une réaction • Inconvénients: interaction entre différents amorces, compromis de sensibilité, design difficile) • Utilité: détection de agents viraux respiratoires ou chez la méningite, ou bactériens producteurs de pneumonies atypique • NESTED-PCR • Augmente la sensibilité avec 2 sets d’amorces dirigés contra la même cible (le 2ème paire d’amorces est utilisé en une 2ème réaction sur le produit d’amplification) • Très sensible mais beaucoup de risques de contamination.

    15. PCR en temps reel • Sondes fluorescents (haute spécificité pour la séquence cible) • Pas besoin de manipulation du produit post-PCR • Prévient les contaminations potentielles. • Plus rapide. quantitative (beaucoup plus précise et moins laborieuse)

    16. Automatisation • 3 étapes techniques: traitement de l’échantillon, amplification acide nucléique et détection du produit. • Automatisation de l’extraction et purification de l’ADN • Automate pour l’amplification et détection • « fully-automated systems » • Screening HIV-1 et VHC (jusqu’à 500 test en 8 heures) Détection des germes responsables des sepsis avec marqueurs de résistance (MRSA, MSSA, BGN, Levures)

    17. PCR en temps reel

    18. Applications de la PCR • Étude phylogénétique (16S rDNA). • Application aux études épidémiologiques, domaine de l’hyène hospitalière • (recherche de pathogènes dans l’eau ou environnement) • Diagnostique • Détection d’organismes non-cultivables, fastidieux ou de croissance lente directement sur l’échantillon (Legionella, Mycobacterium, champignons…) • Détection d’organismes présents en très faible quantités. • dans le cas ou revêt un caractère d’urgence (méningite) • Détection de virus RNA • Mesure de la réponse génétique (mRNA) des organismes à différents stimulations • Recherche d’éléments génétiques d’intérêt, variabilité et expression de gènes.

    19. Applications de la PCRDétection d’organismes non-cultivables ou de croissance lente • Pour certains maladies la PCR a remplacé la culture comme étant le « gold standard » • Hépatite C, méningite entérovirus, coqueluche, encéphalite par herpes simplex, MST par C. trachomatis • Bonne performance pour détecter organismes fastidieux • N. gonorrhoeae • Plus grand impact en virologie clinique: • plus rapide, sensibles et meilleur rapport coût-bénéfice que les méthodes traditionnelles • la sensibilité antivirale n’est pas systématiquement testée. • Découverte de nouveaux agents pathogènes: HCV, Tropheryma Whippelii

    20. Applications de la PCRIdentification des bactéries et champignons • Séquençage du gène 16S rRNA: • Relations phylogénétiques • Nouveaux standard pour l’identification • rapide et donne des informations précises indépendamment des caractéristiques phénotypiques • Désavantages: coût, absence de software d’analyse, bases de donnés limités • kits commerciaux pour séquençage du ribosome

    21. Applications de la PCRPrédire la progression et prise en charge des maladies • Charge virale de VIH-1: • A montré en 1996, risque de progression et mort directement lié à la charge virale plasmatique • Typage viral • VRS du type A, pire pronostique chez les enfants • HPV du type 16 et 18 :haute risque de progression au cancer du col. Types 6 et 11: faible risque. • UTILITE DANS LA PRIS EN CHARGE • Charge virale du CMV • Utile pour débuter une thérapie « pre-emptive » chez les greffes d’organes solides et différencier maladie active d’infection latente • Possible rôle des techniques quantitatives chez autres herpes virus (EBV, HV6)

    22. Applications de la PCRUtilité dans la réponse au traitement • Détection des gènes de la résistance aux antibiotiques • pouvoir supérieur que les méthodes phénotypiques. MRSA, VRE, M.tuberculosis RIF-R. • Néanmoins méthodes classiques restent encore privilégies en termes de coût et information • Rôle dans le monitoring de la réponse aux traitements antiviraux • Charge virale et génotype: • Facteurs indépendamment prédictifs de la réponse à la ribavirine et interféron chez les patients avec hépatite C chronique (> 2 millions copies/mL ou génotype 1 pire réponse). • Paramètres aussi utilisés pour déterminer la duré du tt • Quantification de HIV-1RNA: guide pour débuter, suivie et changer la thérapie antiretrovirale • Détection des mutations responsables de la résistance utiles pour optimiser le traitement • Charge virale VHB et VHC dans l’infection chronique • Persistance de CMV après plusieurs semaines de tt associé à la résistance

    23. Applications de la PCRPrincipaux inconvénients • Contaminations: • Détection des produits d’amplification lente et laborieuse: « réservé pour les pathogènes principaux » • Plate-forme de PCR automatisés ou semi-automatises rendent la technique plus facile. • Validation des résultats: Discrimination d’un porteur versus malade, rôle de l’ADN circulant ? • Disponibilité et Prix • Elle ne possède pas pour le moment le caractère polyvalent d’une mise en culture classique

    24. Applications de la PCRTypage moléculaire des pathogènes nosocomiaux • Typage de souches isolées d’échantillons cliniques • Déterminer l’extension de la diffusion clonale • Identifier les sources de contamination • Vérifier le mode hypothétique de transmission • COMPLEMENT DE L’ENQUETE EPIDEMIOLOGIQUE REALISEE PAR L’EQUIPE D’HYGIENE HOSPITALIER

    25. Applications de la PCRTypage moléculaire des pathogènes nosocomiaux • Individu • Confirmation d’une infection par un germe opportuniste à partir d’un réservoir • Établir le foyer initial et l’extension d’une infection • Distinguer entre une rechute et une réinfection • Investigation d’épidémies • Confirmation de la transmission • Origine de transmission et réservoir • Suivre l’évolution du réservoir • Mesurer l’efficacité des stratégies de maîtrise des infections • Programmes de surveillance • Local, régional, national ou international • Évolution et dissémination de « types » épidémiques • Alerte : nouveau « type »

    26. AFLP typing of Legionella pneumophila serogroup 1: Comparison of Outbreak Cases, Water Outlets and Controls cases Block A water Unrelated control patients Block B water 1 2 M M

    27. Quelques exemples de l’utilité de la PCR en bactériologie • Détection et ID directe de l’espèce dans des échantillons cliniques stériles (LCR, sang, tissus, liquide synovial) en utilisant des amorces spécifiques ou universelles • Organismes à croissance lente ou non-cultivables • Dans des échantillons culture-négatifs provenant de patients sous thérapie antimicrobienne • Endocardites, arthrites, ostéomyélites, méningites

    28. Quelques exemples de l’utilité de la PCR en bactériologie • Legionella • Pneumonie acquise dans la communauté ou nosocomiale (RX) chez patient à risque (immuno-dépression, voyage, contexte épidémique), pneumonie sévère (USI)

    29. Quelques exemples de l’utilité de la PCR en bactériologie indications selon CDM : http://www.uia.ac.be/cmd/

    30. Quelques exemples de l’utilité de la PCR en bactériologie • Bartonella henselae et B. quintana • Confirmation de maladie des griffes du chat (aspiration ou BX ganglionnaires) • Confirmation d’angiomatose bacillaire (biopsie cutanée) • Borrelia burgdorferi • Confirmation de neuroborreliose ou mise au point d’infection chronique du SNC (LCR) • Arthrite aseptique ou chronique ou récurrente (Liq synovial) • Confirmation d’érythème migrant en cas de présentation atypique et sérologie négative (BX cutanée) • Évaluation du suivi thérapeutique

    31. Quelques exemples de l’utilité de la PCR en bactériologie • Chlamydia pneumoniae et Mycoplasma pneumoniae • Enfants ou adultes présentant une toux persistante depuis au mois 14 jours • Pneumonie acquise dans la communauté documenté par RX et sans présomption d’infection par pneumocoques • M. pneumoniae: encéphalite, méningites avec LCR neg • Bordetella pertussis • Toux progressive avec épisodes de toux paroxysmale, reprise inspiratoire sifflante « chant du coq », toux émétisante. • >18 ans: toux progressive >3 s sans maladie pulmonaire • Recherche de contacts dans la famille ou l’institution • Échantillon: aspirations nasoph, sputum

    32. Recherche de gènes de toxines et de résistance aux antibiotiques par PCR • Recherche des gènes pour la toxine diphtérique (C. diphtheriae) • Recherche d’E. coli producteur de vérocytotoxines (VTEC). • Patients souffrant de syndrome hémolytique-urémique, de diarrhée sanglante ou impliqués dans une épidémie de diarrhée. • Gènes de résistance chez les entérocoques • Confirmation de R au glycopeptides (en cas de résultat phénotypique atypique) dans les cas de: • infection clinique, épidémies nosocomiales, admission dans un service à risque • Confirmation du phenotype vanA, et vanB, de E. casseliflavus ou E. gallinarum (phenotype vanC) en cas d'infection clinique • Détection de la résistance aux macrolides chez H. pylori (présence de mutations dans le gène du rRNA 23S) • Sur biopsie gastrique ou de mucus gastrique obtenus par endoscopie (en cas d’infection persistante après un traitement antibiotique incluant des macrolides). • A partir d’une culture en cas de résultat douteux de l’antibiogramme.

    33. Recherche de gènes de toxines et de résistance aux antibiotiques par PCR • Indications de la détection par PCR de la résistance des staphylocoques à la méticilline ou mupirocine(PCR mecA, mupA, mec-nuc, mec-femA) • Souches de staphylocoques: confirmation de la résistance à la méticilline et/ou identification de S. aureus (multiplex PCR): • Souches de S. aureus résistantes à la mupirocine: • confirmation de haut niveau de résistance (CMI >256 µg mupirocin /ml) par détection du gène mupA par PCR

    34. Indications pour l’application de techniques d’amplification moléculaire pour la détection de Hépatite B: • dosage quantitatif d’ADN • Indications: • instauration d’un traitement chez un malade chroniquement HBsAg positif ou HBe Ag positif, ou HBe Ag négatif (mutants précore possibles). • suivi d’un traitement d’hépatite B chronique • poussée aiguë d’hépatite B chronique • Conditions: • tests hépatiques perturbés, particulièrement l’ALT • maximum deux fois par an et par patient • Échantillonnage: • l’échantillon de sang, prélevée spécifiquement pour ce test (éviter la récupération de sang après d’autres tests à cause du risque de contamination) • sérum: tube sec, centrifugation dans le laboratoire local et envoi comme sérum conservé au frais • plasma: sang sur EDTA (jamais d’héparine), centrifugation dans le laboratoire local et envoi comme plasma conservé au frais. • détection qualitative de l’ADN • Ce test peut être utile lors d’incertitude concernant l’existence d’une infection: par exemple anti-HBc isolée ou hépatite chronique séronégative

    35. Détection du virus Varicella Zoster • Malades présentant des symptômes neurologiques: encéphalite, méningo-encéphalite, méningite, myélite. • Malades présentant certaines affections ophthalmologiques, kératite, uvéite, rétinite aigue

    36. PCR HIV-1 ADN • Principe de la méthode • Cette PCR amplifie 3 régions différentes de l’ADN proviral du HIV-1 situées dans les gènes pol env et ltr. • L’ADN proviral est amplifié par une nested PCR (PCR nichée ou emboitée) et les amplicons sont détectés par marquage au bromure d’éthidium et électrophorèse. • Application • Diagnostic de l’infection chez des bébés nés de mère séropositive • Diagnostic de l’infection chez des patients à risque ayant un test de confirmation indéterminé • Diagnostic de l’infection chez des patients immunodéprimés (déficit commun variable,…)

    37. Charge virale HIV - Kit COBAS HIV-1 Amplicor, • Surveillance du patient séropositif pour le HIV-1. • Types d’échantillon • Plasma prélevé sur EDTA de préférence, éventuellement sur citrate. Jamais de plasma hépariné ! • Principe de la méthode(kit COBAS amplicor HIV-1 monitor) • La mesure de la charge virale se fait en quantifiant le nombre de molécules d’ARN viral, sachant qu’un virion contient 2 molécules d’ARN. • Le test Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 est basé sur 5 étapes majeures : • la préparation de l’échantillon, • la transcription inverse de l’ARN cible pour générer l’ADN complémentaire (ADNc), • l’amplification par PCR de l’ADNc à l’aide d’amorces spécifiques du HIV-1, • l’hybridation de l’ADN amplifié avec des sondes oligonucléotidiques spécifiques, • et la détection des sondes hybridées avec l’ADN amplifié grâce à une réaction colorimétrique. • Le test Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 permet la transcription inverse et l’amplification du HIV-1 et d’un Standard de Quantification (QS). Le mélange réactionnel contient une paire d’amorces biotinylées spécifiques des acides nucléiques cibles du HIV-1 et de celui du QS. • La quantité d’ARN du HIV-1 est déterminée à l’aide du standard de quantification (QS).

    38. Détection de Polyomavirus JC et BK • DX de PML (progressive multifocal encephalopathy) sur LCR ou biopsie du cerveau • DX (urines) de cystite hémorragique tardive et prolongée • chez des transplantés de moelle osseuse • chez des patients traités pour une leucémie lymphoblastique aiguë réfractaire. • D’autres indications: • néphrite tubulo-interstitielle chez des patients ayant subi une allogreffe de rein • rétinite atypique chez les patients en immunosuppression.

    39. Entérovirus • Présomption de méningite virale ou de méningo-encéphalite. Échantillon: LCR • Péricardite et/ou myocardite aiguë. Échantillon: liquide péricardique, sang sur EDTA, biopsie myocardique ou péricardique • Diagnostic prénatal de l’infection congénitale • mort fœtale ou retard de croissance fœtale, hydro-, oligo-amnios, épanchement pleural ou péricardique, hyperechogenicité abdominale, calcifications abdominales • Échantillon: sang fœtal sur EDTA, liquide amniotique • Rubéole • Diagnostic prénatal de rubéole congénitale • Patientes avec une séroconversion avant la 16 ème semaine de grossesse.. • Début de la grossesse avec un profil sérologique sur la base duquel il est difficile de déterminer si l’infection a eu lieu juste avant ou après la conception.. • La PCR peut être effectuée sur le liquide amniotique. • Une PCR négative n’exclut pas une infection congénitale

    40. Detection du parvovirus B-19 • Diagnostic de l’infection congénitale, en cas d’anomalies échographiques évocatrices • Crise d’anémie aplasique • Arthropathie • Aplasie de la lignée rouge ou pancytopénie chez les patients immunodéficients • Échantillon: serum (minimum 1 ml) et éventuellement    liquide amniotique ou sang fétal si prénatal    moelle osseuse en cas d’ immunodéficience    liquide synovial en cas d’ arthropathie • détection du Human papillomavirus (HPV) • Diagnostic cytopathologique répété de ASCUS (atypical squamous cells of undetermined significance) ou AGUS (atypical glandular cells of undetermined significance). • Diagnostic répété de LSIL (low-grade squamous intra-epthelial lesions) • Contrôle post-opératoire de maladie HPV résiduelle • détection du virus Herpes Simplex (HSV1 - HSV2) • Malades neurologiques: encéphalite, méningo-encéphalite, méningite, myélite. • affections ophthalmologiques, kératite, uvéite, rétinite aiguë • Herpes du nouveau né • Malades immunodéprimés avec atteintes oesophagiennes ou intestinales observées de visu

    41. Indications pour l’application de techniques d’amplification moléculaire pour la détection de l'infection à cytomégalovirus • Patients immunocompromis • Transplantés de moelle osseuse ou d'organes solides • Patients VIH +(< 100 CD4/mm³) • Patients traités par immunosuppresseurs • Diagnostic de la maladie à CMV: • Symptômes: Pneumonie, atteinte gastrointestinale, hépatite, atteinte du SNC, rétinite, syndrome à CMV(fièvre, leucopénie, thrombocytopénie , perturbation des tests hépatiques). • Échantillons: LBA, LCR, humeurs aqueuse ou vitrée, biopsies tissulaires • Surveillance des patients immunocompromis: • Patient séronégatif pour le CMV greffé avec un organe séropositif ou ayant reçu des transfusionsÉchantillon: sang • Diagnostic prénatal chez la femme enceinte à risque d'infection congénitale à CMV • Infection primaire confirmée: apparition d' IgG et/ou d' IgM chez une patiente habituellement séronegative. • Suspicion d'infection primaire: présence d' IgG et IgM lors de la première investigation sérologique prénatale, le statut sérologique antérieur à la grossesse étant inconnu. Lorsque la première investigation sérologique est réalisée au delà de 3 mois de grossesse, une infection primaire en cours de grossesse ne peut être exclue

    42. Indications pour l’application de techniques d’amplification moléculaire pour la détection de ARN du Virus Hepatitis C • Détermination qualitative • Diagnostic d’une transmission verticale, infection d’un nouveau-né d’une mère HCV positive: analyse du sang du nouveau-né à l’âge de six mois • détection d’ARN HCV chez des patients HCV positifs présentant des signes d’ hépatique chronique (transaminases d’au moins 2 x avec un intervalle de six mois) • confirmation d’une infection HCV, même en cas de anti-HCV négatifs chez des patients immunodéprimés (dialyse rénale, VIH, médication,..) • suivi d’une thérapie • IFN monotherapie: après 3 mois, à la fin du traitement et 6 mois plus tard • IFN + ribavirine: après 3 mois, à la fin du traitement et 6 mois plus tard • Détermination quantitative • Détermination de la charge virale avant le commencement d’un traitement (la charge virale a une valeur pronostique et peut influencer le choix et la durée d’une thérapie) • Seconde détermination du viral load après 12 semaines dans le cas d'un génotype 1 sous traitement. • Genotypage • Détermination du génotype avant le commencement d’une thérapie (le génotype a une valeur pronostique et peut influencer le choix et la durée d’une thérapie) • Les PCR à usage diagnostique peuvent se faire sur • Plasma EDTA, Serum, Biopsie hépatique

    43. Détection et l’identification de human herpesvirus type 8 (HHV8) • Méthodes “conventionnelles” • Sérologie: relativement imprécise (nécessité d’utiliser plusieurs tests)indication de contact avec le viruspas de relation directe avec les maladies associées • Culture: difficile, peu sensible  • Indications cliniques • Diagnostic des maladies associées à l’infection HHV8Sarcôme deKaposi:   • Classique, africain, iatrogène (immunosuppression, greffe), associé à l’HIV, Maladie de Castleman, Primary effusion lymphoma • Éventuellement monitoring d’un traitement • PrélèvementsBiopsies des lésions: sensibilité » 100% (SK)Recherche dans sang périphérique: sensibilité 50-60%

    44. Exemples d’utilité de la PCR en ParasitologiePCR real-time Toxoplasmagondii • Cette PCR amplifie une région de l’ADN parasitaire située dans le gène B1. • L’analyse s’effectue essentiellement dans les cas suivants ( indications selon CDM : http://www.uia.ac.be/cmd/): • Diagnostic de la toxoplasmose congénitale ou de la suspicion de toxoplasmose congénitale • Diagnostic de la toxoplasmose cérébrale chez les patients immunodéprimés • Diagnostic des infections oculaires • Les PCR à usage diagnostique peuvent se faire sur : • Sang total, lymphocytes • Liquides ( LCR, humeur aqueuse ou vitré ) • Biopsies • Liquide amniotique • Sang fœtal • Placenta

    45. Universelle ou spécifique d’espèce Méthode Echantillon Détection d’ADN fongique FUNGAL PCR cible

    46. P. jiroveciiContributions des méthodes moléculaires • Pouvoir diagnostique supérieur que la microscopie dans le sputum induit • Effective pour le diagnostique de formes de pneumocystoses atypiques, dans les échantillons oropharangés et ANP chez les enfants • Sensible et reproductible pour la détection de pneumocystis dans le LBA

    47. P. jiroveciiContributions des méthodes moléculaires Révision des concepts épidémiologiques • Meilleur connaissance de la taxonomie • Démonstration de la bio-diversité • Utile épidémiologique • Réinfections > réactivation • 50% des cas de pneumonie récurrente  souches • Souches R (mutants DHFR) chez patients jamais traités • Type génétique en relation avec la ville du prélèvement et pas avec la ville de naissance • Transmission de la Pneumocystose • Contamination par voi aérienne • Détection de l’ADN dans l’aire • Transmission horizontale • Démontrée chez les animaux • Transmission inter-humaine • Proportion élevée d’un génotype particulier transmis de patients HIV à transplantés d’organes

    48. problème d’Interprétation des résultats: • Porteur? Maladie débutante?Malade? • Organisme vivant? Organisme intact? • Intérêt de la quantification

    49. Nucleic acid detection in proven invasive aspergillosis SF Yeo and B Wong. Clin Microbiol Rev 2002

    50. PCR in Candida fungemia or proven invasive candidiasis SF Yeo and B Wong. Clin Microbiol Rev 2002 VL Kan. JID 1993 JA Jordan JCM 1994 EB Chryssanthou Scan JID 1994 JP Burnie EJCMID 1997 H Einsele JCM 1997 G Morace JCM 1999