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Bacterial Staining (Gram Staining). Sang-heum, Shin Hyoung-Joo, Lee Fermentation and Metabolic Lab. URL: http://www.ajou.ac.kr/~fereng/. 미생물의 현미경 관찰과 염색. 학습목표 현미경의 원리, 종류, 사용법 미생물의 관찰 및 형태학적 특성 미생물 염색의 목적과 원리를 안다 염색방법의 종류와 특징을 안다 그람염색의 중요성과 방법을 이해하고 실습한다. 현미경. 원리 Magnification

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Presentation Transcript
bacterial staining gram staining

Bacterial Staining(Gram Staining)

Sang-heum, Shin

Hyoung-Joo, Lee

Fermentation and Metabolic Lab.

URL: http://www.ajou.ac.kr/~fereng/

slide2
미생물의 현미경 관찰과 염색
  • 학습목표
    • 현미경의 원리, 종류, 사용법
    • 미생물의 관찰 및 형태학적 특성
    • 미생물 염색의 목적과 원리를 안다
    • 염색방법의 종류와 특징을 안다
    • 그람염색의 중요성과 방법을 이해하고 실습한다
slide3
현미경
  • 원리
    • Magnification
    • Contrast
    • Resolution (‡ Resolving power)
  • 종류
    • Bright-field microscopy
    • Dark-field microscopy
    • Phase-contrast microscopy
    • Fluorescence microscopy
    • Electron microscopy

SEM (주사전자현미경)

TEM (투과전자현미경)

slide5
현미경을 통한 미생물 크기 측정

접안 마이크로미터

(ocular micrometer)

대물 마이크로미터

(stage micrometer)

slide6

대물 마이크로미터의 눈금 수

접안 마이크로미터 1 눈금의 길이 ( ocular unit )

=

x 10 μm

접안 마이크로미터의 눈금 수

1. 접안 마이크로미터 1 눈금의 길이 계산 하기

대물 마이크로미터의 눈금 수 = 1접안 마이크로미터의 눈금 수 = 10

따라서 ----- 접안 마이크로미터 1 눈금의 길이 = 1/10 x 10 = 1 μm

2 1 1 10
2. 시야에 그림과 같이 보인다면 접안 마이크로미터 1 눈금의 길이와, 관찰되는 생물체의 크기는 ?(단, 점선은 대물 마이크로미터이고 실선은 접안 마이크로미터이며 대물 마이크로미터 1눈금은 10 ㎛이다.)

접안 마이크로미터 1 눈금의 길이 = 3/5 X 10 = 6 ㎛

생물체의 크기는 = 28 X 6 = 168 ㎛

bacterial morphology
Bacterial morphology

Rod

Spherical (cocci)

Herical and Curve

slide9
미생물의 명명법
  • Binomial nomenclature system

- Latinized name.

- 이탤릭체 또는 밑줄

- First word = Genus name

Second word = Species name

Escherichia coli

microscope techniques dyes staining
Microscope Techniques: Dyes & Staining
  • Simple (positive) staining :

 basic dye (methyle blue, crystal violet, safranin O 등)을 cell을 염색

  • Negative staining : nigrosin, india ink 등으로 배경을 염색
  • Differential staining uses combination of dyes.
  • The Gram stain divides bacteria into TWO groups based upon their cell wall composition:

[Gram-positive vs. Gram-negative]

1차(전) 염색 (crystal violet) → 매염제 → 탈색 → 2차(후) 염색 (safranin)

[The acid-fast stain Mycobacteriumtuberculosis(결핵) and leprosy (나병) ]

1차(전)염색 (carbol fucshin) → heating → 탈색 (HCl-alcohol) → 2차(후) 염색(MB)

  • Specific stains: 세균 내외의 특정한 구조 염색, capsule, spore, flagella staining,
cell structure
Cell structure
  • Gram positive bacteria
  • Gram negative bacteria
gram stain
Gram Stain

1884년 Christian Gram 이 최초로 개발한 이후 현재는 1921년 Hucker 에 의해 시약의 안정성과 균종 감별이 개선된 방법이 사용

slide14
다음 주 예비보고서
  • 순수배양이란 ?
  • 흙으로부터 미생물을 분리하는 방법.
  • 미생물 배양용 배지의 종류.
  • Serial Dilution 이란 ?
slide15

미생물의 분리와 순수배양

Sang-heum, Shin

Hyoung-Joo, Lee

Fermentation and Metabolic Lab.

URL: http://www.ajou.ac.kr/~fereng/

purpose
Purpose

This section is designed to instruct you in

  • 순수배양의 의미를 이해하고 방법을 실습한다
  • 미생물의 분리방법을 이해한다.
  • Culture transfer 방법을 다양한 배지상에서 익힌다.
  • 미생물 배양용 배지의 종류와 제조 방법을 익힌다.
introduction
Introduction
  • Pure culture
    • 의미
      • 세균을 한천배지 등의 배지에서 단일종만이 존재하는 상태에서 배양하는 일
      • L.파스퇴르와 R.코흐에 의하여 확립된 것으로, 어떤 세균 ·원생동물

곰팡이 등을 병원체로 확정하기 위해서는 다른 종류가 혼입되지 않는

상태에서 실험할 필요가 있다.

    • 방법
      • solid media : streak plate
      • poured plate
      • spread plate
      • dilution shake culture
      • Liquid media : dilution method
      • single cell isolation
      • two memberedculture
    • 각 방법의 장점과 단점
culture transfer techniques
Broth

Agar Slant

Culture transfer techniques
  • Agar deep
  • Agar plate
experimental device1
Experimental Device

incubator

clean bench

Stirrer

Water bath

centrifuge

Deep freezeer

Shaking incubator

vortex

Anaerobic jar

pH meter

Fermenter

medium
미생물의 멸균방법

Heat

Filtration

Chemicals

배지의 종류

Arar slants

Agar deep tube

Agar plate

배지제조시 주요 성분의 특징

Glucose, Peptone, Tryptone

Yeast extract, Beef extract, NaCl

K2HPO4, MgSO4, FeSO4, Agar

배지제조의 과정

(a) Label

(b) 접종용 배지와 배양용 배지를

V 형태로 한 손에 쥔다.

(b) Selected colony

(c) Flame the needle or loop

(d) Flame the necks of the tubes

(e) Transfer : zigzag motion

streaking

(f) Flame the necks of the tubes

(g) Recap the tubes

(h) Reflame the loop or needle

Medium
slide23
Nutrient plate

0.1% strach(전분분해효소용)

0.1% skim milk

(단백질 분해효소용)

0.1% tributyrin (지질분해효소용)

Balance를 이용하여 칭량

증류수 첨가, 교반기로 녹인다

pH meter로 pH를 맞춘다

Agar 첨가후, autoclave로 15분 멸균

멸균이 끝나면 48-50℃ 항온수조에 넣고 식힌다

분주

냉장고 보관

Nutrient broth

배지성분을 앞의 방법 1-3의 과정에 준하여 증류수에 녹이고 pH를 맞춘다

Dispenser로 시험관에 5ml씩 분주

Autoclave로 멸균

상온에서 냉각시킨후 냉장 보관

전분분해효소를 생산하는 고온균주의 분리 및 순수배양
slide24
전분분해효소를 생산하는 고온균주의 분리 및 순수배양
  • 실험방법
  • 전분분해 효소 생산 미생물의 분리원 선정
  • 선정된 시료를 멸균용기에 채취
  • 시료를 1차 희석수에 현탁한 후, 10진 희석한 뒤 0.1% strach 함유 nutrient agar plate에 spreading
  • Spreading 한 배지를 55℃ 배양기에서 1-2일간 배양
  • Colony 주변에 전분분해에 의한 clear zone이 형성된 균주를 nutrient broth로 옮겨 배양
  • Broth에서 균주가 생육하면 nutrient agar plate에 옮긴다.
  • Colony가 생길때까지 반복
  • 순수분리균주 glycerol(20%) stock
  • -20℃또는 -70℃ 냉동고 보관
slide26
다음 주 예비보고서
  • 1. 미생물 생육 단계의 특징
  • 2. 미생물 생육 측정 방법
  • 3. 생육에 영향을 미치는 인자
slide27

미생물의 생육 측정 및 생육 영향 인자

Sang-Heum, Shin

Hyoung-Joo, Lee

URL: http://www.ajou.ac.kr/~fereng/Department of Molecular Science and TechnologyAjou University

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실험 목적

미생물의 생육 측정

방법의

종류, 원리 , 특징

Spectrophotometer 원리

Temperature, pH ,NaCl glucose concentration

Optimal

condition

미생물의 생육영향

인자

생육 측정 실습

생육곡선작성, 생육단계구분

introduction1
Introduction
  • 미생물 생육단계의 특징
  • 미생물 생육 측정 방법
  • 생육에 영향을 미치는 인자
  • 측정 기구
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유도기(lag phase)

미생물이 환경에 적응

효소 단백질이 합성

RNA 증가, DNA 일정

세포가 발육하는 시기

대수기(exponential phase)

균이 대수적으로 증가하는 시기

세대시간, 세포의 크기가 일정

세포질의 합성속도, 세포수의 증가가 비례

세포의 생리적 활성이 가장 강한 시기

물리적 화학적 처리에 대한 감수성이 높은 시기

RNA 함량은 일정, DNA 증가

정지기(stationary phase)

세포수는 최대, 생균수는 일정

영양물질의 고갈, 대사성물질의 축적

pH의 변화, 산소부족등으로 생균수는 일정

포자(spore)를 형성하는 시기

증식하는 세포수 = 사멸하는 세포수

사멸기(death phase)

생균수가 감소하고 사균수가 증가하는 시기

효소작용에 의한 DNA, RNA분해, 단백질분해, 세포벽분해, 효소 단백질 변성 등

미생물 생육 단계의 특징
  • 배양 기간 동안 유도기(lag phase), 대수 증식기(exponential phase),

정지기(stationary phase), 사멸기(death phase)의 4 개의 주요 단계

slide32
물리적 요건

(1) 온도

일반적으로 -10~95도 범위에서 생장

Optimum, Miminum, Maximum temperature

- 저온균 (Psychrophile)

- 중온균 (Mesophile)

- 고온균 (Thermophile)

(2) 압력

미생물은 일반적으로 1기압에서 생육

(3) 삼투압

-호당성균(고농도의 당)

- 호염성균, 비호염성균, 중호염성균, 고호염성균

(4) pH

- 산성 세균 (Acidophile)

- 중성 세균 (neutrophile)

- 알칼리성 세균 (Alkalophile)

생육에 영향을 미치는 인자
  • 화학적 요인
    • (1) 수분활성(AW; water activity) :
    • (2) 산소
    • 절대 호기성균 (obligate aerobes)
    • 통성혐기성균 (facultative anaerobes)
    • -절대혐기성균 (aerophobic anaerobes)
    • 미호기성균 (microaerophiles)
    • (3) 탄산가스
    • - 일부 독립 영향균
  • 생물학적 요인
    • (1) Metabolism(공생)
    • 상호 이익관계
    • (2) Competition(경합)
    • 젖산균이 당을 발효, 젖산생성시 부패균 억제
    • (3) Antagonism(길항)
    • 항생물질 생산균
    • (4) Synergism(공동작용)
    • 다른 미생물이 공동으로 새로운 기능 발현
slide33
건조 균체량(Dry weight)

- 배양액 채취, Desicator 건조,중량측정

- 가장 보편적인 방법

- 고형성분이 없는 배지, 세포의 질량 측정

- 곰팡이나 방선균은 비탁법 등의 어려움

균체질소량

; 균체 성분인 질소량을 측정하여 증식도를

측정하는 방법

- 균체량과 질소량이 비례한다는 가정

Packed volume 이용법

- 미생물을 Packed volume 측정용

- 원심분리관에 넣고 원심분리후,

침전되는 균체량 측정

- 배양액 중의 세포 농도를 신속히 측정

- 표준조건하에서 원심분리한 후,

세포가 차지하는 부피 측정

- 상대적인 간접법으로 균사를 생성하는

방선균, 곰팡이 등에 사용

광학적 측정법(비탁법)

광전 비색계를 이용하여 탁도(O.D:optical density) 측정하는 방법

660nm 에서 측정

총균계수법

1.계수반법(counting chamber)

- heamatometer

2.입자계측기법(Coulter count)

- 세포를 적당한 전해질 용액에 부유,

전기저항이 큰 세포가 구멍통과시 pulse로 나타남

3.Membane filter법

- 미생물이 통과할 수 없는 memebrane filter를

이용하여 일정량의 균액을 여과시킨 후 막 위의

세포수를 직접 계수하는 방법

- 100ml/100개 미만

생균측정법

plate counting, MPN method (희석)

균체 성분의 정량

미생물 생육 측정 방법
indirect measurements of microbial growth turbidity
Indirect Measurements of Microbial Growth : Turbidity
  • 미생물의 생장을 측정하는 방법에는 미생물의 건조 중량을 직접적으로 측정하는 방법 외에도 미생물 현탁액의 탁도를 측정함으로써 간접적으로 측정할 수 있는 방법이 있다.
  • 광선이 미생물 현탁액을 통과할 때 산란에 의하여 생기는 투과광량의 감소가 세균의 밀도에 비례한다는 사실에 근거를 두고 있다.
spectrophotometer
Spectrophotometer
  • 파장을 600nm 로 맞춤.
  • 증류수를 넣어 영점을 보정한다.
  • 흡광도를 측정한다.
  • O.D(optical density) 0.2-0.8 범위내에서 측정.
  • 흡광도를 측정한 후 희석배수를 곱한다.
slide36

이러한 투과광량의 측정은 Photometer(광도계) 또는 Spectrophotometer(분광도계)를 사용 한다.

generation time
Generation time
  • 1 개의 세포가 2개로 되는데 소요되는 시간
  • 세대시간계산법, 총균수 = 초기균수 X 2세대시간X b

= a X 2n (a=최초의 균수, n= 세대수, b=균수)

예) 30분마다 분열하는 세균 2마리가 3시간 후에 몇 마리가 되겠는가?

128마리

예) 어떤세균이 14시간 24분에 36회를 분열 하였다면 이 세균의 세대시간은?

24분

materials and methods
Strains

Escherichia coli

Medium

 LB 배지

Culture condition

A. pH : pH4, pH7

B. Glucose : 0%, 0.5%, 1%

C. Temperature : 37, 50OC

D. NaCl : 0%, 1%, 5%

37OCShaking incubator

Spectrophotometer

50ml / 250ml flask

Materials and Methods
  • Seed culture

냉동고에 보관중인 균주를 꺼내서

clean bench 에서 접종(2-3회)

  • Main culture

접종 후 12 h 배양

  • Sampling

2h씩 총 12 h 배양

  • 흡광도 측정

9ml 희석수에 배양액 1ml 첨가

  • Vortex
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예비 보고서
  • 항생물질의 종류, 작용기작
  • 항생물질의 activity 측정방법

- Kirby-Bauer antibiotic sensitivity procrdure (paper disc method)

- MIC (Minimum inhibitory concentration)

  • 소독제 – LOX
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항생물질에 의한 미생물 생육 억제

Sang-heum, Shin

Hyoung-Joo, Lee

Fermentation and Metabolic Lab.

URL: http://www.ajou.ac.kr/~fereng/

slide41

1928년 Alexander Fleming이 penicillin을 처음 발견되고, 1943년 스트렙토마이신이 발견된 이래, 많은 종류의 항생제가 개발되어 감염증의 주요 치료 수단으로 이용되어 왔다. 그러나 1997년에 이르러 “항생제의 마지막 보루”라고 여겨지던 Vancomycin에도 반응하지 않는 세균이 출현하여 항생제 내성 발현 억제와 새로운 항생제의 개발에 대한 관심이 고조되고 있다.

  • 항생제(Antibiotics)와 항균제(Antibacterials)
  • 항생제 내성(Antibiotic Resistance)

항생제의 사용에 따라 이에 대한 방어 수단을 지닌 내성세균이 출현하였다.

그 결과 항생제에 감수성이 큰 세균에 의한 감염증은 감소하고, 내성세균에 의한 감염증은 상대적으로 증가하고 있다. 이들 내성세균의 치료를 위해 인류는 새로운 항생제를 개발하는 노력을 끊임없이 계속하여야 할 것이다.

slide42

세균의 분류

Bacteria are classified as gram positive or gram negative

depending on whether or not they take up gram stain.

(Hans C. J. Gram)

  • Gram positive bacteria
  • Gram negative bacteria
slide43

Gram-positive bacteria

Gram positive bacteria retain the dye Gentian violet taken to the thick cross-linked polysaccharide. Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococci

Gram-negative bacteria

Have additional thick outer membrane, which consists of lipopolysaccharides, proteins, and phospholipids. Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa

slide44

대표적인 항생제 및 항균제

  • - b-Lactam 계
  • - Aminoglycoside 계
  • - Quinolone 계
  • - Tetracycline 계
  • - Sulfonamide와 trimethoprim 계
  • - Glycopeptide 계
  • 구조 및 활성
  • 작용기전
slide46

b-Lactam 계 항생제

β-Lactam 항생제로는 Penicillin, Cephalosporin,

Monobactam, Carbapenem 계 등이 있다.

slide47

b-Lactam 계 항생제는 어떻게 작용하나?

  • 세포벽(cell wall)은 세균의 형태를 유지하고, 삼투압에 의한 세포의 파괴를 방지한다. 따라서
  • 세균이 생존하기 위해서는 세포벽을 끊임없이 합성해야 한다.
  • 세포벽은 polysaccharide와 polypeptide chain 이 covalent link된 peptidoglycan으로 구성.
  • 전구체의 연결에는 transcarboxylase와 transpeptidase가 필요한데, 이들 효소는 penicillin과

잘 결합하는 특성이 있기 때문에 penicillin binding protein (PBP)이라 불린다. 모든 β-lactam

항생제는 이들 PBP와 결합해서 그 활성을 억제하며, 결과적으로 세포벽 합성을 억제해서

항생력을 발휘한다

slide49

Aminoglycoside 계 항생제

Aminoglycoside 항생제로는 Gentamicin , Micronomicin

Streptomycin , Kanamycin 등이 있다.

Gentamicin

Kanamycin

slide50

Aminoglycoside 계 항생제는 어떻게 작용하나?

  • Aminoglycoside는 세균 ribosome의 30S subunit과 불가역적으로 결합해서 단백합성을
  • 저해하는 살균성 항생제이다.
  • Aminoglycoside와 결합된 ribosome은 단백질합성시 mRNA를 해독 (translation)할 수

없게 된다.

  • 또한 aminoglycoside는 ribosome의 유전 정보 오독 (misreading)을 유도해서
  • 엉뚱한 단백질을 합성하도록 하며, 이로 인해서 세균은 사멸하게 된다.
slide51

Quinolone 계 항균제

Quinolone 계 항균제는 1962년 nalidixic acid가 합성된 이래 많은 유도체들이 합성되었는데, 특히 fluoroquinolone 계 화합물들이 널리 개발되고 사용되고 있다. (Norfloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Enoxacin 등)

경구용이며 비뇨기, 호흡기, 피부 및 연조직 감염증에 효능이 있다.

Norfloxacin

Nalidixic acid

slide52

Quinolone 계 항생제는 어떻게 작용하나?

  • Quinolone은 세균의 DNA 합성을 저해하는 살균성 항균제이다.
  • 주 표적은 DNA gyrase(topoisomerase IV)이다.
  • 세균의 DNA는 환상의 이중쇄이며, 그 길이는 균체에 비해서 매우 길다.
slide53

균체보다 긴 DNA가 균체 내에 있기 위해서는 포개지는 수 밖에 없으며,

  • 이와같은 구조화를 supercopiling이라고 한다.
  • 한편 세균이 증식하기 위해서는 DNA를 복제해야 하는데,
  • 이를 위해서는 supercoiling과 2중나선구조를 풀어야 한다.
  • DNA gyrase는 이 과정에 필수적인 효소이며,
  • quinolone은 이 효소를 불활성화해서 DNA 합성을 저해한다.

DNA gyrase

slide54

Tetracycline 계 항생제

  • Tetracycline은 작용시간에 따라서 3가지 group으로 나뉜다.
  • Short-acting tetracyclines: Chlortetracycline, Oxytetracycline,

Tetracycline

  • Intermediate-acting tetracyclines: Domeclocycline,

Methacycline

  • Long-acting tetracyclines: Doxycycline, Minocycline

Tetracycline의 기본 구조

slide55

Tetracycline 계 항생제는 어떻게 작용하나?

  • Tetracycline은 단백질 합성 저해에 의해서 항생력을 발휘한다.
  • 이 항생제는 에너지 의존성 과정에 의해서 세포 내로 침투하며,
  • ribosome의 30S subunit과 가역적으로 결합한다.
  • Tetracycline과 결합된 30S subunit은 aminoacyl tRNA와 결합하지 못하며,
  • 이로 인해서 단백질 합성을 하지 못한다.
slide56

Sulfonamide와 trimethoprim 계 항생제

  • Sulfonamide는 세균의 folic acid 생성에 필수적인 para-aminobenzoic

acid (PABA)와 유사한 구조를 지니고 있다

  • Trimethoprim (TMP)은 pyrimidine 유도체이다
slide57

Sulfonamide와 trimethoprim 계

항생제는 어떻게 작용하나?

  • Sulfonamide는 세균의 folic acid 대사과정의 초기 단계에서 PABA를 dihydrofolic acid로

변환하는 dihydropteroate synthetase 활성을 억제한다.

  • 반면 TMP는 대사의 중간 단계에서 dihydrofolic acid를 tetrahydrofolic acid로
  • 변환하는 dihydrofolate reductase 활성을 억제한다.

포유류의 세포는 folic acid를 합성하지 않으므로, 인체의 purine 생성은 sulfonamide 혹은 TMP에 의해서 영향받지 않는다.

이들 효소의 억제로 인해 purine 합성이 저해되며, 결국 세균은 DNA 합성을 못하게 된다.

slide58

Glycopeptide 계 항생제

Glycopeptide 계 항생제에는 Vancomycin, Teicoplanin, Ristocetin, Avoparcin 등이 있다.

Vancomycin

slide59

Glycopeptide 계 항생제는 어떻게 작용하나?

  • 세균의 세포벽은 peptidoglycan과 teichoic acid로 구성되어 있다.

Peptidoglycan은 전구체가 penicillin-binding protein (PBP)의 작용 (transcarboxylation 및 transpeptidation)에 의해서 서로 연결된 그물 같은 구조이다.

Glycopeptide는 peptidoglycan 전구체의 D-alanyl-D-alanine 말단에 결합해서 PBP가 이 말단에 결합하지 못하게 한다.

그 결과로 peptidoglycan 전구체는 transpeptidation에 의한 상호간의 연결을 못하게 되며, 따라서 그물 같은 구조의 세포벽 합성을 못하게 된다.

slide61

세균은 항생제의 공격을 어떻게 피하는가?

  • Case 1. 효소에 의한 항균제의 파괴 및 구조 변화
  • Case 2. 표적 물질의 변화
  • Case 3. 세포막의 항균제 투과성 변화
  • Case 4. 세포 밖으로 항균제를 유출(using efflux pumps)

Bacteria become resistant to antibiotics either through genetic mutations or by acquiring resistance genes from other bacteria.

Resistance is cyclical. Current emphasis is on gram-positive infections.

slide62

효소에 의한 항균제의 불활성화

  • β-Lactamase가 그 대표적인 예이다.
  • β-Lactamase는 β-lactam 고리를 가수분해하여 항균력을
  • 무력화시킨다.
slide63

표적 물질의 변화

  • 항균제가 결합하는 세균의 표적 단백질을 변화시키거나,

표적 단백질의 과량생성에 의해서 내성을 획득하는 세균도 있다.

S. aureus는 변성된 PBP (PBP 2’)의 생성에 의해서 methicilin에 내성을 가진다. PBP 2’은 기존의 PBP에 비해서 b-lactam 고리와의 친화도가 매우 낮다.

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세포막의 항균제 투과성 변화

세포 외막의 porin 단백질은 항균제가 세포 내로 들어가는 통로이다. 항균제는 porin 단백질을 소실한 세균의 세포 내로는 침투할 수 없으므로, porin 을

소실, 변이시킨 세균은 항균제에 내성을 가진다.

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세포 밖으로의 항균제 유출

Gram-negative bacteria can have one- or three-component efflux pumps that remove the antibiotic from a cell. Related but different pumps may work together to efflux the same substrates

일부 세균은 세포내로 유입된 항균제를 능동적으로 유출한다.