IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO

1. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO

2. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO • opracowano szereg metod oczyszczania plazmidowego DNA, z których każda obejmuje trzy etapy: hodowlę bakterii (i ewentualnie amplifikację plazmidu), lizę bakterii, oczyszczanie plazmidowego DNA • plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem • wysokokopijne wektory plazmidowe (np. z serii pUC), otrzymywane są z hodowli znajdującej się w późnej fazie logarytmicznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko- i średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane • w tym celu do częściowo wyrośniętej hodowli dodaje się w tym celu chloramfenikol, który selektywnie zapobiega replikacji chromosomu bakteryjnego • we wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA genomowym a DNA plazmidowym bakterii: • DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidu • podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently closed circle).

3. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO • odwirowane komórki bakteryjne ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna) • stosowany może być również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową bakterii (nie działa w pH<8.0) • w metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje całkowitą lizę komórki jak również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach • w przypadku otrzymywania plazmidowego DNA metodą termiczną, czynnikiem denaturującym jest wysoka temperatura, w której DNA genomowy i plazmidowy zachowują się podobnie jak w wysokim pH • następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od związanych z nim białek. Zwykle stosuje się do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chloroformem i alkoholem izoamylowym. • białka można również usunąć przez trawienie ich proteinazami (zwykle proteinazą K). Usunięcie kwasu RNA przeprowadza się enzymatycznie, inkubując próbki z RNazą (wolną od DNazy), przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości (patrz, dalej)

4. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO • w metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji, natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci serowatego osadu • z odbiałczonych próbek DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izopropanolem w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego • wszystkie metody otrzymywania plazmidowego DNA, z wyjątkiem lizy alkalicznej, wymagają oddzielenia tego DNA od DNA genomowego w gradiencie chlorku cezu w obecności bromku etydyny • wykorzystuje się tu fakt, że bromek etydyny intensywniej interkaluje do zdenaturowanego DNA genomowego niż do DNA plazmidowego, powodując częściowe rozwinięcie helisy DNA i wydłużenie cząsteczki, co powoduje zmniejszenie jej gęstości pławnej • różnica w gęstości pomiędzy formą CCC a liniową i kolistą OC (ang. open circle) wynosi około 0.04 g/ml i jest wystarczająca do oddzielenia superzwiniętego DNA podczas wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu w obecności bromku etydyny

5. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO • pasmo superzwiniętego DNA układa się poniżej pasma utworzonego przez liniowe fragmenty chromosomowego DNA oraz formy liniowej i OC plazmidu • cząsteczki RNA mają największą gęstość i zbierają się na dnie probówki, zaś białka pozostają w górnej warstwie roztworu • oczyszczanie plazmidowego DNA przeprowadzić można również metodą wirowania lizatów komórkowych w gradiencie alkalicznej sacharozy stosując wymieniacze jonowe (np. kolumienki Qiagen) lub filtrację na żelach. • w środowisku alkalicznym formy liniowe i OC ulegają rozdzieleniu na pojedyncze nici i sedymentują 3-4 razy wolniej niż niezdenaturowana superzwinięta forma CCC,

6. Protokół 7 • Izolacja plazmidowego DNA przy pomocy zestawu Plasmid Mini (DNA Gdańsk) • zestaw przeznaczony jest do izolacji plazmidowego DNA z 1.5-3 ml hodowli bakteryjnej • zastosowana w zestawie procedura opiera się na zdolności wiązania DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych • w pierwszym etapie bakterie poddawane są lizie alkalicznej, a następnie lizat zobojętniamy jest buforem GL3, który powoduje precypitację chromosomalnego DNA i białek, pozostawiając jednocześnie plazmidowe DNA w roztworze • po odwirowaniu próbki, supernatant zawierający plazmidowe DNA nanoszony jest na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym; DNA przechodząc przez złoże osiada na nim, podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą nie wiążąc się • po wypłukaniu z kolumny resztek zanieczyszczeń, oczyszczone DNA plazmidowe wymywane jest buforem TE lub wodą i nadaje się do bezpośredniego wykorzystania bez konieczności precypitacji • DNA uzyskane przy użyciu tego zestawu doskonale nadaje się do wszelkich metod stosowanych w biologii molekularnej, w tym do automatycznego sekwencjonowania. • Uwagi • Pojemność minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 20μg • SDS znajdujący się w roztworze L2 precypituje w niskich temperaturach, dlatego gdy roztwór nie jest klarowny należy ogrzać go w temperaturze 40ºC do uzyskania całkowitej klarowności

7. Protokół izolacji • Osad z 1.5-3 ml nocnej hodowli bakterii dokładne zawiesić przez pipetowanie lub worteksowanie w 200 µl roztworu do zawieszania L1. • Dodać 200 µl alkalicznego roztworu lizującego L2 i po wymieszaniu przez kilkukrotne odwracanie probówki pozostawić na 3 minuty w temperaturze pokojowej. • Uwaga! • Po dodaniu roztowru L2 należy ostrożnie mieszać zawartość probówki aby nie spowodować fragmentacji chromosomalnego DNA. Zwykle wystarczy 5-6 krotne odwrócenie probówki. Po 3 minutach inkubacji lizat powinien być całkowicie klarowny. Jeżeli nie jest należy odwrócić lizat kilka razy i przedłużyć czas inkubacji o dalsze 3 minuty. • Dodać 400 µl roztworu zobojętniającego GL3 i wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki • Wirować 10 minut przy 11 tys. RPM. • Ostrożnie wlać supernatant do minikolumny do oczyszczania plazmidowego DNA. • Wirować 1 minutę przy 11 tys. RPM. Wyciągnąć minikolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć ją do probówki.

8. Protokół izolacji • Dodać do kolumny 500µl pierwszego roztworu płuczącego W. Wirować 1 minutę przy 11 tys. RPM. • Wyciągnąć minikolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki. Dodać do kolumny 700 µl drugiego roztworu płuczącego A1. • Wirować 2 minuty przy 11 tys. RPM. Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce 1.5 ml i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać 60 µl roztworu TE lub wody. • Próbkę inkubować 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wirować 1 minutę przy 12 tys. RPM. • Kolumnę usunąć a oczyszczone plazmidowe DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać w lodówce do czasu dalszych analiz.