1 / 74

Metody separace proteinů

Metody separace proteinů. Literatura. Anzenbacher , Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, 1986. Ferenčík, Škárka : Biochemická laboratorní technika. Alfa Bratislava 1981. Literatura. Separace. kvalitativní Analytické

gayle
Download Presentation

Metody separace proteinů

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metody separace proteinů

  2. Literatura Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, 1986. Ferenčík, Škárka : Biochemická laboratorní technika. Alfa Bratislava 1981.

  3. Literatura

  4. Separace kvalitativní Analytické kvantitativní Preparativní Charakterizace – pI, MW, spektra, AMK …

  5. Separační metody Vychází z klasických metod chemické analýzy Uplatňují se zde i speciální metody

  6. Problémy se vzorkem Komplexnost Malá množství Labilita

  7. Zásady pro práci s biologickým materiálem Teplota pH + iontová síla Koncentrace Pěnění Lokální přebytky Proteasy, RNAsy, DNAsy

  8. Separace bílkovin

  9. Plánování separace

  10. Cíl izolace Získání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivity Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí

  11. Volba vstupního materiálu Preparát z daného organismu Preparát s největším obsahem dané bílkoviny Preparát s nejmenším obsahem nečistot

  12. Volba a kombinace separačních metod Selektivita Rozlišovací schopnost Kapacita Zpětný výtěžek Náklady – materiál, přístroje, člověk Stupeň zřeďování a koncentrace Slučitelnost mezi metodami Znalosti o dané bílkovině (pI, MW)

  13. Základní zásady Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením  velké množství levného vstupního materiálu Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná  ve vzorku již investovaná práce

  14. Pořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovaly Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími Metody nepoužívat opakovaně

  15. Sledování průběhu separace

  16. Sledování průběhu separaceSDS PAGE

  17. Stanovení koncentrace bílkoviny

  18. Kjeldahlova metoda – stanovení N2 Mineralizace vzorku – převedení organického N na NH4+ Stanovení NH4+ - titrace, fotometrie, selektivní elektrody

  19. Kjeldahlova metoda – stanovení N2

  20. UV spektrofotometrie 280 nm – aromatické AMK interference nukleotidů 180 - 230 nm – peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace

  21. UV spektrofotometrie

  22. UV spektrofotometrie

  23. UV spektrofotometrie Vzorce pro přímé UV stanovení: c (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260 c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51 c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01 c (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)]

  24. UV spektrofotometrie Edelhochova metoda při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule. e280 = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M-1.cm-1)

  25. VIS spektrofotometrie Přídavek činidla  barevný derivát Destruktivní metoda Nutná kalibrační závislost

  26. Biuretová metoda Princip : Cu2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby Cu2+ Měření : 540 – 560 nm 310 nm

  27. Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany(FolinCiocalteovo reagens) na molybdenovou modř Měření : 725 nm

  28. Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm

  29. Lowryho metoda • biuret  • Lowry

  30. Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm

  31. Metoda dle Bradfordové

  32. BCA metoda Princip : Na+ sůl k. bicinchoninové (BCA), komplexujeCu+ tvořené reakcí peptidové vazby s Cu2+ Měření : 562 nm

  33. BCA metoda

  34. Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu na bílkovinu  měření vzniklé fluorescence (OPA) Měření : exc.340 nm em.440 nm - zhášení fluorescence přídavkem bílkoviny

  35. Polarografie Princip : Brdičkova reakce – SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co2+ katalytické reakce na Hg elektrodě  proud

  36. Nejčastěji používané metody

  37. Nejčastěji používané metody

  38. Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atd.

  39. Vlastní separace

  40. Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace

  41. Vstupní materiál

  42. Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy - psychrofilní organismy

  43. Mikroorganismy • CCM uchovává více než 3 000 kmenů bakterií (asi 1 400 druhů) a 800 kmenů vláknitých hub (přibližně 550 druhů), které nabízí ve svém Katalogu kultur. • Specializovaná sbírka vodních hyfomycetů obsahuje asi 500 kmenů (60 rodů se 130 druhy).

  44. Selekce optimálních producentů snadné získání producenta snadnost purifikačního postupu maximální produkce enzymu

  45. Mikroorganismy

  46. Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává

  47. Živočišné tkáně Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci Jateční zvířata – orgány, krev Člověk – tělní tekutiny

  48. Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách, tabák, Arabidopsisthaliana Nevýhoda – problematický růst za definovaných podmínek

  49. Manipulace s biologickým materiálem Pokud možno zpracovat co nejdříve Zmražení - při – 60 - 80 oC Rozmrazování - co nejrychleji

  50. Rozbití a extrakce

More Related