รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์ 2557

1. Protein Synthesis : Translation and Posttranslational Modifications รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์ 2557

2. Protein synthesis • Translation • คล้ายคลึงกันทั้งใน prokaryote และ eukaryote • สารตั้งต้น คือ กรดอะมิโน 20 ชนิด • ชนิดของโปรตีนที่สังเคราะห์ ถูกกำหนดโดย mRNA • การสังเคราะห์โปรตีนเริ่มจากจุดเริ่มต้นทางด้าน NH2-terminal ไปสิ้นสุดที่ COOH-terminal • ในมนุษย์สามารถพบการสังเคราะห์โปรตีนได้ทั้งใน cytosol, RER และ mitochondria

3. ปัจจัยที่ใช้ในการสังเคราะห์โปรตีนปัจจัยที่ใช้ในการสังเคราะห์โปรตีน • L-amino acid • t-RNA • Genetic code • Aminoacyl-tRNA synthetase • ribosome

4. Amino acid

5. Transfer RNA (tRNA) • มีประมาณ 50 ชนิด โดยกรดอะมิโนบางชนิดมี tRNA ที่เป็นคู่มากกว่า 1 ชนิด • Clover leaf หรือ L-shape • tRNA จะมีเบส 3 ตัวที่ complementary กับ codon บน mRNA เรียกเบส 3 ตัวนี้ว่า anticodon • Wobble position

6. Transfer RNA (tRNA)

7. Wobble position • Wobble position (base) คือ เบสที่อยู่ตำแหน่ง 3’ ของ codon และเบสตำแหน่ง 5’ ของ anticodon ซึ่งโดยทั่วไป การจับคู่กันของเบสคู่นี้อาจไม่เป็นไปตามกฎทั่วไปของการจับคู่ • การมี wobble base ทำให้ tRNA 1 ชนิด จับกับ codon ของ mRNA ได้มากกว่า 1 codon

8. Genetic code Second position U C A G UUU UAU UGU UCU Tyr Cys Phe UGC U C A G UUC UAC UCC U Ser UUA UCA UAA UGA STOP Leu STOP UCG UUG UAG UGG Trp CUU His First position CAU CAC CCU CCC CCA CCG CGU CGC CGA CGG U C A G CUC Leu C Pro Arg CUA Third position Gln CUG CAA CAG AUU AUC AUA Asn Ser lle ACU ACC ACA ACG AGU AGC U C A G AAU AAC Thr A Lys Met Arg AUG AAA AAG AGA AGG GUU GUA GUG Asp GCU GCC GCA GCG GAU GAC U C A G GUC GGU GGC GGA GGG Gly Ala Val G Glu GAA GAG

9. Genetic code • รหัสพันธุกรรม • แต่ละรหัสประกอบด้วย nucleotide 3 ตัว เรียงต่อกัน เรียกว่า triplet code หรือ codon • สิ่งมีชีวิตทุกชนิด ทั้ง prokaryote และ eukaryote ใช้ genetic code เดียวกัน (ยกเว้นใน mitochondria ของมนุษย์มีรหัสบางรหัสต่างออกไป) จึงอาจเรียกว่า universal genetic code • Genetic code บน mRNA จะมีแต่ละ codon เรียงต่อกันไป โดยไม่มีการเว้นวรรค (commaless) และไม่ซ้อนกัน (non-overlapping)

10. Genetic code • รหัสพันธุกรรมมีทั้งหมด 64 รหัส (43 = 64) โดย 61 รหัสจะเป็นรหัสสำหรับกรดอะมิโน 20 ชนิด ที่เหลือ 3 รหัส เป็นรหัสสำหรับหยุดการสังเคราะห์โปรตีน • กรดอะมิโนส่วนใหญ่จะมีรหัสพันธุกรรมมากกว่า 1 รหัส เรียก degenerate • มีกรดอะมิโน 2 ชนิด (methionine และ tryptophan) ที่มีรหัสพันธุกรรมรหัสเดียว • AUG เป็นรหัสพันธุกรรมสำหรับ methionine และเป็นรหัสเริ่มต้นการสังเคราะห์โปรตีน เรียกว่า initiation codon • UAA, UAG และ UGA เป็นรหัสที่หยุดการสังเคราะห์โปรตีน เรียกว่า nonsense (stop) codon

11. Gene mutation & protein synthesis • Regulatory element mutation : ทำให้การเกิด transcription เปลี่ยนแปลง (เพิ่มขึ้น/ลดลง) ส่งผลให้ปริมาณของโปรตีนเปลี่ยนไป • Structural gene mutation : ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงต่าง ๆ ดังนี้ • Missense mutation • Nonsense mutation • Chain termination (sense) mutation • Splicing mutation • Silent mutation • Frameshift mutation

12. Structural gene mutation • Missense mutation : โปรตีนมีกรดอะมิโนเปลี่ยนไป CAU (His) CAG (Gln) • Nonsense mutation : โปรตีนสั้นลง (truncated polypeptide chain) CGA (Arg) UGA (stop) • Sense mutation : โปรตีนยาวขึ้น UAA (stop) UAC (Tyr)

13. Structural gene mutation • Silent mutation AAA (Lys) AAG (Lys) • Frameshift mutation Pro Gln Trp Ser Arg His 3′ Normal 5' C C A C A G U G G A G U C G A C A U U Mutant 5' 3′ C C A C A G U G G A A G U C G A C A U (base insertion ) Pro Gln Trp Lys Ser Thr

14. Aminoacyl-tRNA synthetase • ทำหน้าที่จับคู่กรดอะมิโนกับ tRNA ที่เป็นคู่กัน (cognate tRNA) เรียกขั้นตอนนี้ว่า activation of amino acid amino acid + ATP + tRNA aminoacyl-tRNA + AMP + PPi PPi 2Pi ขบวนการนี้อาศัย Mg2+เป็น cofactor และต้องการ ATP (2 ATP) • เอนไซม์นี้มี 20 ชนิด แต่ละชนิดจำเพาะกับกรดอะมิโนแต่ละตัว

15. Aminoacyl-tRNA synthetase • การจับกันของกรดอะมิโนกับ tRNA เกิดจาก α-COOH group ของ กรดอะมิโนกับ 3’-OH group ของ tRNA จับกัน เกิดเป็น high energy ester bond ซึ่งพลังงานของพันธะนี้จะใช้ในการสังเคราะห์ peptide bond ต่อไป • เอนไซม์นี้ยังสามารถ proofreading ตรวจสอบ aa-tRNA ที่เกิดขึ้น โดยถ้า aa-tRNA มีโครงสร้างที่ผิด เอนไซม์จะสลาย aa-tRNA กลับเป็นกรดอะมิโนและ tRNA

16. Ribosome • ตำแหน่งที่เกิดการสังเคราะห์โปรตีน • ประกอบด้วย 2 subunits (small & large subunit) • large subunit ประกอบด้วย • P site : เป็นบริเวณที่เกิดสาย polypeptide • A site : เป็นบริเวณที่ aa-tRNA มาเกาะ • Prokaryotic ribosome : 70S (50S & 30S) • Eukaryotic ribosome : 80S (60S & 40S)

17. Process of translation • Initiation • Elongation • Termination

18. Initiation • การ identify จุดเริ่มต้นของ coding sequence บน mRNA (ซึ่งก็คือ codon AUG ตัวแรกจากด้าน 5’) • ปัจจัยที่ใช้ในขั้นตอน initiation • mRNA • Met-tRNA (ใน prokaryote ใช้ formyl methionyl-tRNA) • ribosome • initiation factors (IF) • GTP • ATP

19. Process of initiation (eukaryotes) • eIF2a จับกับ GTP และ Met-tRNAiได้เป็น ternary complex • Ribosome แยกเป็น 2 subunit โดย 40S subunit รวมกับ eIF3, ternary complex และ eIF4c ได้เป็น eIF2a.Met-tRNAi.GTP, eIF3.40S, eIF4c complex • complex นี้จะจับ mRNA ทางด้าน 5’ ได้เป็น preinitiation complex ซึ่งต้องอาศัย ATP และ IF ในการอ่านรหัสจากด้าน 5’ ไปด้าน 3’ จนถึง codonAUG ชุดแรก

20. Process of initiation (eukaryotes) • anticodon ของ tRNA เกิด base pairing กับ AUG ของ mRNA ทำให้ GTP ถูกเปลี่ยนเป็น GDP • IF ต่าง ๆ และ GDP ถูกปล่อยออกมา และ 60S subunit ของ ribosome เข้ามารวม เกิดเป็น initiation complex

22. Process of initiation (prokaryotes) • มีลำดับของพิวรีนนิวคลีโอไทด์ที่เรียกว่า Shine-Dalgarno sequence อยู่ประมาณ 10 นิวคลีโอไทด์ ทางด้าน upstream ของ AUG • IF ต่าง ๆ น้อยกว่า ใน eukaryote AUG 5' 3' mRNA Prok. Shine-Dalgarno sequence ( 10 nt. upstreamของ AUG ) initiation complex อยู่ที่ P site ของ ribosome

23. Elongation • เกิดขึ้นหลังการเกิด initiation complex • ribosome จะต่อสาย peptide ให้ยาวขึ้นโดยการอ่าน codon บน mRNA ไปเรื่อย ๆ จนถึง termination codon • ปัจจัยที่ใช้ คือ • initiation complex • aminoacyl-tRNA ที่รวมกับ eEF1αและ GTP เป็น complex • elongation factors (EF) • GTP

24. Process of elongation • eEF-1αที่จับกับ GTP จะพา aa-tRNA ไปรวมกับ initiation complex ที่ A site • เกิด base pairing ระหว่าง base ของ codon บน mRNA กับ anticodon บน aa-tRNA ทำให้ eEF-1αกับ GTP เปลี่ยนเป็น GDP. eEF-1αต่อมา GDP หลุดออกจาก ribosome ปล่อย aa-tRNA ไว้ที่ A site ของ ribosome • peptidyl transferase ใน ribosome สลาย ester bond ระหว่างกรดอะมิโนกับ tRNA ที่ P site แล้วนำ α-COOH group มาต่อกับ α-NH2 group ของกรดอะมิโนอีกตัวที่ A site

25. Process of elongation • เกิด translocation ย้าย peptidyl-tRNA จาก A site มาที่ P site โดยอาศัย eEF-2 (translocase) และ GTP • deacylated tRNA จะเคลื่อนที่จาก P site ไป E site • เมื่อ A site ว่าง aa-tRNA ตัวใหม่จะเข้ามาจับ และเกิดขบวนการต่าง ๆ ดังที่กล่าวมาใหม่

26. Process of elongation

27. Termination • เกิดเมื่อ ribosome สังเคราะห์ peptide จนมาถึง termination codon (UAA, UAG หรือ UGA) • eRF และ GTP จะจับที่ A site • ปล่อย deacylated tRNA จาก E site • ปล่อย peptide ที่สังเคราะห์ได้ออกจาก ribosome

28. Process of termination

29. Energy requirement for protein synthesis • Aminoacylation of tRNA ATP AMP + Ppi • Binding of Met-tRNAi to P site • Aminoacyl-tRNA binding to A site • Translocation • Termination

30. Polyribosome (polysome) • mRNA สายเดี่ยวแต่มี ribosome เกาะอยู่หลายกลุ่ม • เกิดจากเมื่อ ribosome เริ่มสังเคราะห์โปรตีนไปแล้ว ribosome ตัวใหม่จะเริ่มสังเคราะห์โปรตีนอีกโมเลกุลได้โดยไม่ต้องรอให้ ribosome ตัวแรกสังเคราะห์โปรตีนจนจบสายก่อน • การมี polyribosome ทำให้เซลล์สังเคราะห์โปรตีนได้เร็วขึ้น

31. Polyribosome

32. Inhibitors of protein synthesis • affect on prokaryotes : streptomycin, tetracycline, chloramphenicol & erythromycin • affect on eukayotes : cycloheximide & diphtheria toxin • affect both prokaryotes & eukaryotes : puromycin

33. Inhibitors of protein synthesis

34. Protein folding Hsp60 • การสังเคราะห์โปรตีน ทำให้เกิด 1° structure ของโปรตีน • สำหรับการเกิด 2° และ 3° structure โปรตีนบางชนิดสามารถเกิดได้เอง (self-assembly) แต่โปรตีนบางชนิดต้องอาศัยโปรตีนชนิดอื่นเป็นตัวช่วย เช่น • molecular chaperone (heat shock protein) ป้องกันการเกิดโครงสร้างที่ไม่ต้องการ และทำให้โปรตีนเสถียร • prolyl isomerase เปลี่ยน cis-trans isomer ของ proline ในโปรตีน binding Cycle repeated many times

35. Protein folding • mutation บางชนิด ทำให้การเกิด protein folding ผิดปกติไป และทำให้โปรตีนดังกล่าวไม่สามารถถูกส่งออกจาก ER ได้ • ตัวอย่างเช่น mutation ของ α1-antiprotease (ทำหน้าที่เป็น elastase inhibitor) abnormal folding of α1-antiprotease retention of α1-antiprotease within hepatocyte elastase activity ในปอดสูงขึ้น lung destruction

36. Protein translocation (protein targeting) • การเคลื่อนย้ายโปรตีนจากบริเวณที่สังเคราะห์ไปยังบริเวณที่โปรตีนทำงาน แบ่งได้เป็น 2 กลุ่ม 1. Post-translational translocation 2. Cotranslational translocation

37. Post-translational translocation • การเคลื่อนย้ายโปรตีนที่เกิดหลังจากการสังเคราะห์โปรตีนเสร็จสิ้น • เกิดที่ free ribosome • พบในการสังเคราะห์โปรตีนเพื่อใช้ใน nucleus, cytosol, mitochondria และ peroxisome

38. Cotranslational translocation • การเคลื่อนย้ายโปรตีนที่เกิดขณะที่การสังเคราะห์โปรตีนยังไม่สิ้นสุด • พบในการสังเคราะห์โปรตีนที่เป็นส่วนประกอบของ membrane และ secretory protein เช่น โปรตีนใน ER, Golgi body, lysosome • โปรตีนในกลุ่มนี้จะมี signal sequence ที่ด้าน N-terminus • ขั้นตอนการเกิด cotranslational translocation • Signal sequence จะจับกับ signal recognition particle (SRP) • SRP จะพาโปรตีนและ ribosome ไปจับกับ SRP receptor (docking protein) ที่ ERและโปรตีนจะถูกส่งเข้าไปใน lumen ของ ER • เมื่อสังเคราะห์โปรตีนเสร็จ singal sequence จะถูกตัดออก • โปรตีนใน lumen ถูกส่งไป Golgi body และเกิด exocytosis

39. Cotranslational translocation

40. Secretion • เป็นขบวนการส่งโปรตีนที่สังเคราะห์ออกไปใช้นอกเซลล์ แบ่งได้เป็น 2 ประเภท • Constitutive secretion • ตัวอย่างเช่น การส่ง plasma protein ออกนอกเซลล์ • Regulated excretion • โปรตีนที่สังเคราะห์จะถูกเก็บไว้ใน secretory vesicle • เมื่อเซลล์ถูกกระตุ้น โปรตีนจะถูกปล่อยออกมาโดยวิธี exocytosis

41. Intracellular protein degradation • โดยทั่วไปโปรตีนแต่ละชนิดจะมี half-life ต่างกัน เช่น ในเซลล์ตับ เอนไซม์ที่ควบคุม metabolism จะสลายเร็วกว่าโปรตีนอื่น • โปรตีนที่มี PEST sequence (proline-glutamate-serine-threonine) มากจะมี half-life สั้น

42. Intracellular protein degradation การสลายโปรตีนในเซลล์ • ATP dependent proteolysis เกิดขึ้นใน proteasomes โดยอาศัยโปรตีน ubiquitin • Lysosome degradation • Other proteolytic systems - Apoptosis หรือที่เรียกว่า programmed cell death อาศัยเอนไซม์ caspases - Calcium-dependent thiol proteases ที่เรียกว่า calpains

43. Ubiquitin-ATP dependent pathway • ทำหน้าที่สลายโปรตีนที่ผิดปกติ หรือหมดอายุการใช้งาน เช่น regulatory protein และ protein ที่เกี่ยวข้องกับการแบ่งตัวของเซลล์ • ubiquitin จะจับกับ NH3+ group ของ lysine ของโปรตีนต้องการสลาย โดยอาศัย E1, E2และ E3 • จากนั้น protease complex จะสลายโปรตีนและปล่อย ubiquitin ออกไปใช้ได้ใหม่

44. Ubiquitin-ATP dependent protein degradation

45. Lysosome degradation เป็นการสลายโปรตีนโดย protease ของ lysosome ที่เรียกว่า cathepsins ซึ่งแบ่งออกตามหน้าที่ได้ดังนี้ • Exocytosis เป็นการส่งเอนไซม์ออกไปสลายโปรตีนนอกเซลล์ • Autophagic เป็นการสลาย organelle ภายในเซลล์ • Phagocytosis เป็นการสลายโปรตีนที่เข้ามาในเซลล์ • Autolysis of cell เป็นการสลายตัวเองของเซลล์

46. Lysosome degradation

47. Posttranslational processing • โปรตีนบางชนิดหลังจากสังเคราะห์เสร็จแล้ว จะมีการเปลี่ยนแปลงภายในโมเลกุลของมันก่อน จึงจะทำงานได้ตามปกติ • ขบวนการเปลี่ยนแปลงนี้ ได้แก่ • proteolytic cleavage: การเปลี่ยน zymogen หรือ prohormone ให้เป็น active form • covalent modification : γ-carboxylation, hydroxylation, N-methylation, phosphorylation, acylation และ prenylation

48. Proteolytic cleavage • การเปลี่ยน zymogen เป็น enzyme ที่ออกฤทธิ์ได้ trypsinogen trypsin factor XII factor XIIa • การเปลี่ยน prohormone เป็น hormone proinsulin insulin pro-opiomelanocortin ACTH + MSH + (POMC) β-endorphin

49. γ-carboxylation • เกิดที่ glutamate บางตัวของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการแข็งตัวของเลือด • ปฏิกิริยานี้ต้องอาศัย vitamin K

50. Hydroxylation • การเติม –OH ที่ side chain ของกรดอะมิโนบางตัว • ตัวอย่างเช่น hydroxylation ของ proline และ lysine ใน collagen โดยเอนไซม์ proline hydroxylase และ lysyl hydroxylase ได้เป็น hydroxyproline และ hydroxylysine ตามลำดับ • ขบวนการนี้จำเป็นต่อการเกิด H-bond ระหว่างสาย collagen • ปฏิกิริยานี้ต้องอาศัย vitamin C