Identificazione dei microrganismi

1. Identificazione dei microrganismi • esame microscopico diretto del materiale in esame • Caratteristiche morfologiche • Colorazione di Gram • Colorazione di Ziehl-Neelsen • Caratteristiche colturali • Caratteristiche biochimiche • Tipizzazione fagica • Caratteristiche antigeniche (Diagnosi sierologica) • Antibiogramma

2. Paziente (sospetta malattia infettiva) Via immunologica Prelievo di sangue Via microbiologica Ricerca di anticorpi contro il sospetto patogeno Sangue Feci Urine Biopsia Prove sierologiche (RIA, ELISA) Microbiologia tradizionale Microbiologia innovativa Immunologia (ricerca del patogeno: batteri o virus) Biologia molecolare (ricerca del genoma del patogeno) Coltura in un terreno selettivo Immunofluorescenza ELISA DNA-probes PCR Isolamento Identificazione Prove selettive Identificazione immunologica Sensibilità agli antibiotici (decisione sulla chemioterapia)

3. Diagnosi sierologica di infezione batterica DIRETTA: ricerca di proteine o altri componenti (=antigeni) del microrganismo A tale scopo devono essere disponibili sieri iperimmuni o anticorpi monoclonali che reagiscono specificamente solo con il patogeno che si ricerca. La disponibilità di sieri iperimmuni e di anticorpi monoclonali, specifici per i vari antigeni presenti sul corpo batterico (antigeni dei flagelli H, dei pili F, delle strutture pilo- simili K/F, della capsula K, della parete cellulare O), permette di eseguire prove immunologiche specifiche adatte a identificare con precisione un microrganismo. INDIRETTA: ricerca di anticorpi specifici per il batterio d’interesse

4. Identificazionecon sieri iperimmuni o anticorpi monoclonali Agglutinazione ELISA Immunofluorescenza IFA Metodi diretti

5. Fissazione del complemento Agglutinazione Precipitazione ELISA Immunofluorescenza IFA Western blot Metodi indiretti

6. Scelta del metodo diagnostico • DIAGNOSI DIRETTA: maggiore specificità ma… • DIAGNOSI INDIRETTA: generalmente meno costosa, e più accessibile • La scelta dipende da: • FASE DELLA MALATTIA • Il batterio o gli anticorpi devono essere presenti nel campione da analizzare • CARATTERISTICHE del batterio • Il batterio, se si sceglie il metodo diretto, deve essere coltivabile (isolam) o in grande quantità (ELISA) • VALORE DIAGNOSTICO DI UN EVENTUALE TITOLO ANTICORPALE • Gli Ac devono, se presenti, voler dire qualcosa… • TIPO DI TEST • Screening, test su caso sospetto e conferma?

7. CAMPIONI CLINICI per la diagnosi diretta • CAMPIONI MONOMICROBICI • DAL SANGUE • Plasma Frazione liquida del sangue non coagulato. • importante l’anticoagulante • Siero Frazione liquida del sangue coagulato • LIQUOR CEFALORACHIDIANO • Usare tale e quale

8. CAMPIONI CLINICI per la diagnosi diretta CAMPIONI POLIMICROBICI: di solito vanno trattati TAMPONI immersi in liquido di trasporto (PBS, 20% FCS o BSA, antibiotici, antimicotici) URINA diluita 1:2 in VIB Filtrata, centrif a 15000 Semina del pellet FECI Diluite 1:5 o 10 in VIB. Centrif a bassa velocità. Supernatante centrif a alta velocità. Semina del pellet (cloroformio) BRONCOLAVAGGI diluiti, rimosso muco. GARGARIZZATI Tenute lecellule BIOPSIE omogenate in VIB, centrif.

9. Nella diagnosi diretta, la sierologia è deputata al riconoscimento del germe. Si acquistano già pronti anticorpi di origine animale, marcati diversamente a seconda del loro uso. Molto usati sono gli ANTICORPI MONOCLONALI. Diagnosi diretta

10. Ag Ag Ag Ag Ag Ab L'agglutinazione permette di individuare anche antigeni solubili multivalenti (antigeni capsulari) avvalendosi di matrici inerti al lattice ( di forma generalmente sferica) coniugate con immunoglobuline specifiche note sensibilizzate (le immunoglobuline sono legate sulla superficie delle sfere) dirette contro un certo antigene. L'agglutinazione si visualizza con formazione di granuli sul fondo della provetta o su particolari cartoncini a fondo scuro.  AGGLUTINAZIONE (metodo diretto) Una colonia del batterio in esame viene stemperata in una goccia di antisiero o di anticorpo monoclonale, specifico per il batterio sospettato (Salmonella, Brucella) posta su vetrino: se l'anticorpo riconosce il microrganismo reagisce con i corpi batterici, causando, entro pochi minuti, la loro agglutinazione visibile ad occhio nudo. Le reazioni di agglutinazione su vetrino possono essere rese più evidenti impiegando anticorpi preventivamente coniugati con particelle di lattice; in tal modo l'agglutinazione può essere osservata agevolmente a occhio nudo anche quando gli anticorpi reagiscono con specifiche strutture antigeniche poco rappresentate nel corpo batterico. L'agglutinazione con anticorpi coniugati a particelle di lattice viene impiegata con successo per la diagnosi rapida di Staphylococcus aureus, Streptococchi patogeni, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Cryptococcus neoformans, Candida albicans.

11. REAZIONI ANTIGENE-ANTICORPO

12. ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOASSORBENT ASSAY)(metodo diretto) • E’ una tecnica fra le più usate: Semplice, sensibile, veloce (2 ore alla risposta), economica, reagenti stabili. • Puo’ essere resa quantitativa con una curva di taratura. Campione Es: feci,urina etc Perossidasi o Fosfatasi alcalina Anticorpo marcato con enzima microrganismo Anticorpo che “cattura”

13. “ELISA diretto” per la ricerca di antigeni nei campioni biologici

14. FASE 1: L’ anticorpo di cattura immobilizzato su fase solida lega l’ antigene se questo è presente nel campione

15. FASE 2: dopo lavaggio viene aggiunto il secondo anticorpo che lega l’ antigene solo se questo è stato precedentemente legato

16. FASE 3: dopo ulteriore lavaggio viene aggiunto il substrato. Si sviluppa una reazione colorimetrica solo in presenza dell’ enzima perossidasi. Se il pozzetto si colora, la reazione è positiva FASE 4: Si blocca la reazione e si effettua la lettura fotometrica

17. IMMUNOFLUORESCENZA (metodo diretto) • E’ una delletecniche più sensibili (fino a 1000 molecole antigeniche se localizzate). • Serve per rilevare antigeni (si adoperano anticorpi noti) anche a localizzazione intracellulare (Chlamidia, Rickettsiae). • Permette di: • visualizzare la localizzazione di un antigene (citoplasmatica, di membrana, nucleare). • determinare più antigeni o marcatori sulla stessa cellula, utilizzando fluorocromi diversi

18. Immunofluorescenza diretta

19. Immunofluorescenza diretta

20. Immunofluorescenza diretta

21. Immunofluorescenza diretta

22. Fissazione del complemento Agglutinazione Precipitazione ELISA Immunofluorescenza IFA Western blot Metodi indiretti

23. SIERODIAGNOSI indiretta Per la ricerca delle IgGoccorrono campioni appaiati: • A 7 gg dalla comparsa dei sintomi IN FASE ACUTA • A 1-2 settimane dal primo IN CONVALESCENZA E’ considerato indicativo di infezione un titolo almeno 4 volte maggiore nel secondo campione Per la ricerca delle IgM basta un campione solo. • Compaiono nei primi giorni • Il picco è dopo 7-10 gg • Scompaiono nei mesi successivi. SONO QUINDI INDICATORI DI INFEZIONE ACUTA • Ricompaiono durante le infezioni ricorrenti e riacutizzazioni • Determinate nel sangue cordale, indicano infezione neonatale

24. SIERODIAGNOSI indiretta Gli anticorpi possono essere chiamati diversamente a seconda del saggio usato per determinarli e della loro funzione : Agglutinanti o opsonizzanti (agglutinine e opsonine) Fissanti il complemento…compaiono più lentamente e spariscono prima.. I test disponibili danno come risultato il titolo delle Ig totali. Poco sensibili. Ig totali • …misurate con RIA o ELISA o IFA. • I test possono determinare anche la classe IgM, IgG, IgA. Test di conferma: Western blot o Immunoblot

25. TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO • Originariamente messo a punto da Wassermann per la diagnosi di sifilide. • Misura IgG e IgM (ossia gli anticorpi in grado di attivare o fissare il complemento C’) nel siero • Vantaggi: stessi reagenti eccetto l’antigene, per tutti i test • Svantaggi: componenti labili, • stretto margine di condizioni ottimali

26. TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO batterici Sistema rivelatore: un altro complesso antigene anticorpo VISIBILE, cioè globuli rossi con anticorpi anti-globulo rosso (si dicono sensibilizzati)

27. TEST DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO +/- + Reazione di Wassermann Diagnosi sierologica della sifilide; utilizza sia l’antigene lipoideo che l’antigene proteico

28. AGGLUTINAZIONE e PRECIPITAZIONE (metodo indiretto) Reazione antigene-anticorpo applicata a scopo sierodiagnostico per individuare la presenza di agglutinine (anticorpi agglutinanti) nel siero di pazienti. PRECIPITAZIONE (in cui si utilizzano antigeni solubili non legati a cellule) AGGLUTINAZIONE( in cui sono necessarie cellule nella loro interezza per formare un reticolo dato dall'unione dell'anticorpo a due cellule contigue). * A differenza dell'agglutinazione, la precipitazione è più rapida (15 min.) anche a temperatura ambiente (20-25°C) ma risente in maggior misura del rapporto ottimale antigene-anticorpo, inoltre non si manifesta quando i sieri campione sono diluiti oltre 10-50 volte

29. AGGLUTINAZIONE (metodo indiretto) • LA SIEROAGGLUTINAZIONE DI WRIGHT E’ LA RICERCA DI AGGLUTININE NEL SIERO DEL PAZIENTE NEI CONFRONTI DI UNA SOSPENSIONE DI BRUCELLE IN FASE S. SI PREPARANO DILUIZIONI SCALARI DEL SIERO (1:50 a 1:3200) E SI AGGIUNGE UNA OPPORTUNA QUANTITA’ DI SOSPENSIONE ANTIGENE. LA LETTURA SI ESEGUE DOPO 48h A 37°C INDICANDO IL TITOLO SIGNIFICATIVO CIOE’ UN TITOLO SUPERIORE A QUELLO RISCONTRATO NELLA POPOLAZIONE NORMALE (superiore a 1:100) • LA REAZIONE DI WIDAL E’ UTILIZZATA PER EVIDENZIARE INFEZIONI SOSTENUTE DA SALMONELLA TYPHI E SALMONELLA PARATYPHI. PREFERIBILMENTE VIENE ESEGUITA UTILIZZANDO SOSPENSIONI SEPARATE DI ANTIGENE O ED H PERCHE’ LA POSITIVITA’ VERSO L’UNO O L’ALTRO DEI DUE ANTIGENI HA UN SIGNIFICATO CLINICO DIFFERENTE • AGGLUTINAZIONE FIOCCOSA PER L’ANTIGENE H AGGLUTINAZIONE GRANULARE PER L’ANTIGENE O LA REAZIONE E’ CONSIDERATA POSITIVA SE SUPERIORE AD 1:50

30. TPHA (reazione di emoagglutinazione indiretta) Agglutinazione indiretta di emazie di pulcino con anticorpi specifici contro le varianti patogene di Treponema pallidum

31. TPHA

32. Titolo risultante 1 a 1280, diluizione in cui è ancora possibile verificare un’ agglutinazione netta.

33. PRECIPITAZIONE (metodo indiretto) La precipitazione avviene quando l'antigene in soluzione acquosa, viene posto a contatto con l'anticorpo (siero) in presenza di elettroliti (soluzione fisiologica) ad una opportuna temperatura e tempo di incubazione. Il titolo precipitante di un siero è determinato valutando la più piccola quantità di esso che sia in grado di precipitare una quantità standard fissa di antigene. Il grado di attività di un siero è indicato dall'ultima diluizione che consente di evidenziare la reazione.

34. ELISA(metodo indiretto) • E’ una tecnica fra le più usate: Semplice, sensibile, veloce (2 ore alla risposta), economica, reagenti stabili. • Puo’ essere resa quantitativa con una curva di taratura. • CATTURA DI ANTICORPO per diagnosi indiretta • A, legato a supporto solido (fondo di piastra o biglia), è antigene virale • B è un anticorpo specifico per A (per es: nel siero di un paziente sieropositivo).

35. ELISA indiretto • Un microrganismo, o antigeni di, è legato al supporto. Si ricerca nel siero l’anticorpo. • Nel passaggio successivo si usano Ig anti-Ig umane marcate con perossidasi. Campione: siero Anticorpo marcato con enzima Anticorpo microrganismo

36. ELISA

37. “Elisa indiretto”

38. FASE 1:gli anticorpi specifici presenti nel siero (Ac primario) si legano all’ antigene immobilizzato su fase solida

39. FASE 2:dopo lavaggio viene aggiunto l’ Anticorpo anti-immunoglobulina di specie marcato con perossidasi(Ac secondario). Se sono presenti anticorpi nel siero primario, si forma un complesso antigene- Ac primario- Ac secondario

40. FASE 3: dopo ulteriore lavaggio viene aggiunto il substrato. Si sviluppa una reazione colorimetrica solo in presenza dell’ enzima perossidasi. Se il pozzetto si colora, la reazione è positiva

41. Immunofluorescenza indiretta • 1)    microrganismo o antigene noto  • 2)  si aggiunge il siero campione contenente eventuali anticorpi diretti contro il microrganismo o antigene noto  • 3)  si lava per allontanare l'eccesso di anticorpo non legato al batterio  • 4) si aggiunge un anticorpo marcato diretto contro la regione costante della catena pesante degli anticorpi eventualmente presenti nel siero saggiato  • 5)  si lava per allontanare l'eccesso di anticorpo marcato  • 6)  si osserva con il microscopio a fluorescenza •  *Il metodo indiretto consente di identificare una grande varietà di antigeni utilizzando un sol tipo di anticorpo rivelatore. Infatti quest'ultimo essendo diretto contro la regione costante della catena pesante delle immunoglobuline può essere utilizzato indifferentemente verso qualsiasi anticorpo utilizzato per il riconoscimento dell'antigene.

42. WESTERN BLOT o IMMUNOBLOT Test che misura la PRESENZA di anticorpi nel siero. Non è quantitativo. E’ utilizzato solo come test di conferma a causa del suo costo e/o laboriosità. CONSENTE LA VISUALIZZAZIONE DEI SINGOLI ANTIGENI CONTRO CUI E’ RIVOLTA LA RISPOSTA ANTICORPALE

43. Western blotting • Identifica gli antigeni verso cui reagisce un siero • L’ identificazione avviene in base al peso molecolare della proteina • E’ un test molto sensibile e specifico • E’ un test costoso e poco pratico da applicare routinariamente

44. Principio del test • L’ antigene (spesso una miscela di antigeni) viene sottoposto ad elettroforesi su gel di poliacrilammide • Il gel viene fissato e le diverse frazioni vengono trasferite su matrice solida (membrana di nitrocellulosa) • Su tale membrana vengono saggiati i sieri (1 per ogni striscia) • Gli anticorpi specifici vengono visualizzati mediante anti-IgG di specie marcate e substrato colorimetrico

45. 1 fase: separazione elettroforetica

46. 1 fase: separazione elettroforetica

47. 1 fase: separazione elettroforetica

48. 1 fase: separazione elettroforetica

49. 2 Fase: trasferimento su membrana

50. 3 fase: preparazione delle strisce di nitrocellulosa