COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI

1. COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI La coltivazione “in vitro” dei microrganismi

2. I sistemi nutritivi vengono chiamati “Terreni di coltura” o “mezzi o substrati di crescita”. • Nei Terreni di coltura i microrganismi restano vitali e si moltiplicano originando popolazioni di milioni di individui: le colture microbiche.

3. FATTORI della CRESCITA MICROBICA • I microrganismi sono ubiquitari e, pertanto, si possono prelevare ovunque (alimenti, campioni di acqua, campioni di suolo, etc.) • Il trasferimento dei microrganismi dai loro ambienti naturali nei terreni di coltura origina delle COLTURE MISTE dato che il microambiente è popolato da specie microbiche diverse. • Per poter studiare le caratteristiche delle singolo specie è importante disporre di COLTURE PURE cioè di popolazioni geneticamente uguali e derivate da un un unico microrganismo di partenza.

4. FATTORI della CRESCITA MICROBICA • Per ottenere le Colture pure occorre pertanto usare delle tecniche particolari per isolare i microrganismi che ci interessano e porli in coltura pura. • CLONE o LINEA PURA: è l’insieme di cellule che derivano per divisioni successive da un’unica cellula progenitrice. • CEPPO: è una linea pura di una determinata specie, isolata da una fonte (habitat) specifica. • Ciascun ceppo può differire per uno o più caratteri rispetto al CEPPO TIPO rappresentato dalla coltura isolata e identificata per la prima volta e utilizzata per la descrizione della specie.

5. I Centri di conservazione dei “ceppi tipo”o Centri di risorse biologiche (BRC) • I diversi ceppi delle varie specie, compresi i ceppi tipo, sono conservati da enti specializzati, chiamati Centri di risorse biologiche (BRC) che hanno il compito di mantenere le collezioni di microrganismi. • Praticamente, sono delle banche di microrganismi che verificano le caratteristiche delle colture e le conservano, custodendone in tal modo la biodiversità e la stabilità genetica. • Una delle principali collezioni internazionali di microrganismi è l'American Type Culture Collection(ATCC), fondata nel 1925 negli Stati Uniti, che possiede una raccolta di ben 18.000 ceppi batterici diversi.

6. Italia - Perugia: il DBVPG cioè la“Collezione dei Lieviti Industriali - Industrial YeastsCollection” • La Collezione, inizialmente denominata “Collezione dei Lieviti Vinari dell’Istituto di Microbiologia Agraria e Tecnica” (acronimo IMAT), è stata fondata all’inizio del 1900 quando la Scuola Superiore di Agricoltura decise di includere la microbiologia (una scienza ancora agli inizi) all’interno dei propri corsi di studio. • Nel 1984, l’Istituto di Microbiologia Agraria e Tecnica (che ospitava la Collezione IMAT) si fuse con l’Istituto di Botanica, creando il Dipartimento di Biologia Vegetale. Di conseguenza, la Collezione IMAT assunse la nuova denominazione di “Collezione dei Lieviti Industriali - Industrial YeastsCollection” e l’acronimo fu cambiato in DBVPG. La sede è situata presso il Dipartimento di Biologia Applicata dell’ Università di Perugia. • Indirizzo web: http://www.agr.unipg.it/dbvpg/

7. COLTURE MICROBICHE DA CEPPI PURI (o ceppi tipo) DELLE COLLEZIONI INTERNAZIONALI • Pertanto, invece di prelevare i microrganismi da campioni naturali, si possono allestire le colture microbiche a partire dai ceppi puri delle collezioni internazionali, conservati nella ceppotecadel laboratorio. Questo offre il vantaggio di sapere quale specie microbica si sta manipolando, conoscerne le caratteristiche e soprattutto sapere il livello di rischio relativo alla manipolazione di un determinato microrganismo; • raccogliendo, invece, i microrganismi dai loro habitat naturali non conoscendo le specie presenti, non si può escludere che tra di esse vi siano ceppi patogeni.

8. CRESCITA DEI MICRORGANISMI IN LABORATORIO SIGNIFICA SODDISFARE LE LORO ESIGENZE VITALI • Per far crescere i microrganismi in laboratorio e cioè favorire la loro riproduzione, bisogna soddisfare le esigenze vitali delle singole specie che, vista l'ampia varietà metabolica dei microrganismi, sono molto diversificate. • Molte specie sono state identificate e classificate e ne conosciamo i caratteri colturali cioè le condizioni ambientali necessarie alla loro riproduzione e, quindi, alla crescita della coltura. • Sono caratteri colturali fondamentali: • Fonti di carbonio ed energia, • nutrienti particolari, • temperatura, • presenza o meno dell' ossigeno, • pH (reazione del substrato) • concentrazione osmotica del mezzo. • Tali caratteri devono essere attentamente considerati nella preparazione dei cosiddetti TERRENI DI COLTURA.

9. “…non tutti i microrganismi riescono a crescere in laboratorio…” • Non tutti i microrganismi sono, però, coltivabili in laboratorio. Per alcuni non si è infatti, riusciti a ricreare, in vivo, le condizioni di sviluppo degli ambienti naturali,probabilmente per scarse conoscenze sulle esigenze delle singole specie o per la mancanza della possibilità, per la specie in esame, di stabilire relazioni indispensabili con alcune popolazioni, come avviene nelle comunità naturali. Esempi di microrganismi che non si è riusciti a coltivare in laboratorio sono molti microorganismi del suolo e anche alcuni patogeni, come: • Treponema pallidum(spirocheta, agente della Sifilide) e • Mycobacteriumleprae((conosciuto anche come Bacillo di Hansen o BH, bacillo agente eziologico della lebbra) • Per altri microrganismi la coltivazione risulta molto difficile, come ad esempio per Heliobacter pilori, batterio responsabile dell'ulcera gastrica e duodenale.

10. Microrganismi VBNC: “Viablebutnotculturable”, vitali ma non coltivabili • Si è osservato che alcune specie, normalmente coltivabili in laboratorio, dopo periodi prolungati di conservazione in laboratorio e permanenza in condizioni di stress, come ad esempio per scarso apporto di nutrienti o basse temperature, trasferite in terreni freschi non danno luogo a una crescita visibile. • Si è ovviamente pensato che la mancanza di crescita fosse dovuta alla morte dei microrganismi, ma alcune ricerche hanno evidenziato che le cellule, "rianimate" con nutrienti o fattori chimico-fisici particolari, erano vitali, avendo ripreso a riprodursi. • Questa condizione, la cui genesi non è ancora ben compresa, viene indicata con l'acronimo o sigla VBNC, dall'inglese ViableButNotCulturable,cioè vitali ma non coltivabili. • Essa riguarda diverse specie batteriche, come Escherichia coli, Listeriamonocytogenes, Vibriovulnificuse Legionella pneumophila.

11. Per definizione, un batterio in VBNC è metabolicamenteattivoe allo stesso tempo incapace di andare incontro a scissione per riprodursi. • La cellula batterica in VBNC riduce di molto le sue dimensioni ed assume una forma sferica ("coccica"), forse per ridurre al minimo le richieste energetiche e nutritive del metabolismo. • La "resuscitazione" dal VBNC (cioè il ritorno al normale stato della cellula che diventa pertanto “coltivabile”) è un processo stimolato da un fattore opposto a quello che ha indotto il VBNC; può richiedere ore o giorni per essere completata.