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CITOQUIMICA “APLICADA A LA HEMATOLOGIA”. Bqca. Ivan María Victoria Hematología Clínica 2011. La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias.

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citoquimica aplicada a la hematologia

CITOQUIMICA “APLICADA A LA HEMATOLOGIA”

Bqca. Ivan María Victoria

Hematología Clínica

2011

slide2

La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias.

MORFOLOGÍA <----->BIOQUÍMICA

  • Son un complemento de las tinciones hematológicas.
  • Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias inorgánicas.
  • Así se mejora la diferenciación celular.
  • También sirven para el diagnóstico de ciertas leucemias.
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70-80%

CITOMORFOLOGIA.

CITOQUIMICA.

90-95%

INMUNOFENOTIPO

99-100%

MAS

MICROSC. ELECTRN.

CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR

tres pasos fundamentales
Tres pasos fundamentales:
  • Fijación: preservar las estructuras y reactividad funcional de las células.
  • Incubación en el medio de reacción: como consecuencia se generan productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado.
  • Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de reacción .

Las reacciones deben tener 3 características: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad.

muestras utilizadas
MUESTRAS UTILIZADAS
  • EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA
  • PUNCION DE MÉDULA ÓSEA
  • PUNCION DE GANGLIOS
  • LCR
tipos de tinciones
TIPOS DE TINCIONES

Se pueden clasificar en:

  • Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretende colorear, se pueden dividir en vitales y no vitales.
  • Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el Dx hematológico, se dividen en tradicionales y especiales.
tinciones vitales y no vitales
TINCIONES VITALES Y NO VITALES
  • Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están vivas.
  • Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. Son colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno.
  • Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden.
  • Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos.
tinciones tradicionales y especiales
TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES
  • Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina (eosina).
  • Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos (azul de metileno).
  • Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro (eosinato de azul de metileno).
  • Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante (Sudán III)
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También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polícromas.

  • Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras.
  • Y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas.
las reacciones citoqu micas pueden tambi n clasificarse seg n el mecanismo qu mico involucrado
Las reacciones citoquímicas pueden también clasificarse según el mecanismo químico involucrado

1-Progresivas estables: Son reacciones que exigen un tiempo mínimo pero no un máximo.

2-Progresivas indefinidas: En estas la reacción continúa y puede hacer ilegible el preparado o conducir a valores erróneos.

3-Fugaces: Son las que pierden color rápidamente y no pueden conservarse mucho tiempo.

clasificacion de las t cnicas citoqu micas
CLASIFICACION DE LAS TÉCNICAS CITOQUÍMICAS

CITOQUÍMICA CLÁSICA

CITOQUÍMICA ELCTRÓNICA

CITOQUÍMICA FLUORESCENTE

INMUNOCITOQUÍMICA

NO FLUORESCENTE

CITOQUÍMICA AUTOMATIZADA

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Citoquímica Clásica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse e interpretarse con el microscopio óptico común.

Citoquímica electrónica: Se caracteriza por ser una metodología de elevada sensibilidad

Citoquímica Fluorescente:puede o no ser inmunocitoquímica, se fijan sobre distintas estructuras de las células y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores.

Inmunocitoquímica no fluorescente:Se basa en la marcación de anticuerpos con sustancias que son capaces de dar reacciones citoquímicas intensamente coloreadas que permiten su revelación.

Fisicocitoquímíca electroforéticaPermite reconocer determinados componentes de las organelas celulares obtenidas en solución mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un campo eléctrico y la identificación por reacciones citoquímicas, permite identificar complejos isoenzimáticos, mientras que los métodos citoquímicos simples revelan una enzima en bloque.

Citoquímica automatizada: Es el fundamento de la CMF que utiliza la citoquímica fluorescente

citoquimica fluorescente
CITOQUIMICA FLUORESCENTE:
  • INMUNES
  • NO INMUNES

P

S

consideraciones practicas
CONSIDERACIONES PRACTICAS
  • Conservación de la muestra (FAL)
  • Condiciones de la reacción
  • Observación la microscopio (ausencia/presencia/,morfología/distribucion)
  • Interpretación (score o ausencia/presencia)
  • Estandarización
  • Reactivos utilizados
citoquimica clasica
CITOQUIMICACLASICA

Reconocimiento de principios no enzimáticos:

  • Hidratos de carbonos: PAS
  • Fe hemosiderínico: PERLS
  • Lípidos: Red Oíl/Sudan Black
  • Hemoglobina fetal: elución acida
reconocimientos por principios enzim ticos
Reconocimientos por principios enzimáticos:
  • MPO
  • FAL
  • FAC
  • ESTERASAS
  • CATALASAS
  • ENZIMAS HIDROLITICAS
tinciones clasicas
TINCIONES CLASICAS:

1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS

tinci n de pas peryodic schiff acid
TINCIÓN DE PAS (Peryodic Schiff Acid)

Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo púrpura intenso.

-C-C- ALDEHIDOS “PURPURA”

ACIDO PERYODICO SCHIFF

tincion de perls
TINCION DE PERLS
  • Los gránulos de hemosiderina detectables citoquímicamente mediante la reacción de Perls.
  • Se basa en la liberación de los iones férricos de su unión con las proteínas por la acción del ácido clorhídrico; dichos iones férricos al reaccionar con el ferrocianuro potásico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico.
  • Por esta reacción se detecta el Fe hemosiderínico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble.
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Sideroblastos en anillo

Reflejando una anormalidad en la acumulacion de Fe en las mitocondrias

(azul de prusia)

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En el estudio del Fe medular hay que valorar conjuntamente 3 parámetros:

nº de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofágico.

Básicamente se presentas 3 patrones:

1) nº sideroblastos alto y Fe de depósito aumentado: es frecuente hallarlo en estados anémicos que cursan con sobrecarga férrica.

2)nº sideroblastos bajo y Fe de depósito disminuido o ausente: es el patrón característico de la anemia ferropénica pura; de aparición muy precoz en un balance férrico negativo.

3)nº sideroblastos bajo con acúmulo de Fe en los macrófagos medulares. Este patrón disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrófagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.

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Hemocromatosis

(cortes histológicos de hígado)

hemoglobina fetal test de kleihauer betke
HEMOGLOBINA FETALTest de Kleihauer-Betke
  • La hemoglobina fetal (HbF o 22) es ácido y álcali resistente. Por consiguiente, sometiendo un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos.
  • Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean con eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras.
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Esta prueba se usa para determinar si hay GR del feto en una mujer embarazada con un grupo sanguíneo Rh(-).

sudan black red oil
SUDAN BLACK / RED OIL

Ambas se utilizan para la detección de lípidos, en el caso del Sudan Black este tiñe los fosfolípidos y esteroles de membrana de los gránulos.

mieloperoxidasa
MIELOPEROXIDASA

La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato (bencidina) en presencia de peróxido de hidrógeno, apareciendo un precipitado azul en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reacción.

BENCIDINA

H2O2

MPO

resultados
Resultados….
  • ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS
  • GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : MIELOBLASTOS AGRANULARES 30% POSITIVOS.
  • NEUTRÓFILO ES SIEMPRE POSITIVO 100% ??
  • EOSINÓFILO TAMBIÉN , PERO COLOR PARDO AMARILLO
  • BASÓFILO EN 50%
  • LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS
  • MONOCITOS: POSITIVOS EN GRÁNULOS DISPERSOS.
estres oxidativo scorificaci n de mpo en granulocitos
“ESTRES OXIDATIVO”Scorificación de MPO en granulocitos:
  • Se categorizaron los neutrófilos de acuerdo al contenido de gránulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4, en orden creciente.

Grado 1: Escasas granulaciones teñidas dispersas (fig.3 y 4)

Grado 0: Sin granulaciones teñidas. (fig. 1 y 2)

scorificaci n de mpo en granulocitos
Scorificación de MPO en granulocitos:

Grado 2: Regulares granulaciones sin cubrir el núcleo (fig. 5)

Grado 3: abundantes granulaciones teñidas en todo su citoplasma sin llegar a cubrir completamente el núcleo. (fig.6 )

scorificaci n de mpo en granulocitos1
Scorificación de MPO en granulocitos:

Grado 4: granulaciones que cubren la célula completamente dándoles un aspecto de casquete. (fig.8 y 9)

fosfatasa alcalina
FOSFATASA ALCALINA
  • La fosfatasa alcalina es una hidrolasa perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas.
  • Ligeros cambios de pH determinan una rápida inactivación de la enzima.
  • Es un marcador de granulaciones secundarias o especificas.
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La demostración citoquímica se basa en la hidrólisis de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos productos intermedios que combinados con una sal diazoica dan un precipitado coloreado.

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.

Se encuentran actividad FA en algunas células maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrofilica (segmentados y bandas)

La actividad granulocitica de la FA se manifiesta en forma de un precipitado de color pardo negruzco localizado en el citoplasma

ndice de actividad de fal
Índice de actividad de FAL
  • Grado 0: sin reacción
  • Grado I: coloración difusa o con pequeños puntos coloreados
  • Grado II: mayor densidad cromática, por lo general en la zona del hilio nuclear.
  • Grado III: mayor granulación oscura, tiñe todo el citoplasma.
  • Grado IV: completamente oscuro
fosfatasa acida
FOSFATASA ACIDA

Se basa en la hidrólisis del substrato

naftol-AS-Bi-fosfato.

La aplicación práctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de los síndromes linfoproliferativos crónicos (LPC) y leucemia aguda linfoblástica (LAL), dónde existe una buena correlación entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana.

fac lt y lb
FAC LT(+) Y LB (-)

El 90% de las LAL de origen T dan una reacción + intensa de localización centrosómica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.

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LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.

Tricoleucemia: Tinción fosfatasa ácida (+) tartrato resistente

esterasas
ESTERASAS

4 sustratos:

  • Naftol-AS-C-cloroacetato (CAE)
  • Naftol-AS-D-acetato
  • α-naftil-acetato
  • Α-naftil-butirato

hidrolizados “precipitado insoluble”

“sal diazoica”

esterasas1
ESTERASAS

Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar ésteres en sus componentes ácidos y alcoholes. Existen diferentes variedades según el substrato empleado.