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Tecnologia do DNA recombinante

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Tecnologia do DNA recombinante

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  1. Tecnologia do DNA recombinante

  2. A deficiência de hormônio do crescimento faz com que a pessoa fique com uma estatura baixa. Nesses casos, é necessário o uso hormônio do crescimento para que o crescimento dessas crianças melhore. • O hormônio do crescimento foi um dos primeiros produtos da engenharia genética. • Ele foi produzido em E. coli a partir de um gene humano fusionado com elementos reguladores bacterianos. • Esse foi o segundo produto farmacêutico aprovado pelo FDA, em 1985. • O primeiro foi a insulina humana, em 1982.

  3. Como amplificar um gene de interesse

  4. Tipo de DNA doador • DNA genômico • cDNA – DNA complementar

  5. cDNA – contém apenas os éxons

  6. DNA de interesse Formação de uma molécula de DNA recombinante vetor

  7. Enzimas de Restrição

  8. Como funciona a amplificação

  9. VETORES Plasmídeos: são moléculas de DNA circulares, extracromossômicas, presentes em microrganismos, sendo que muitos se replicam autonomamente.

  10. Estrutura de dois plasmídeos

  11. Vetores de bacteriófagos • A maioria  fago labda • Genoma do fago: 48.502pb • 15kb são necessários para a lisogenia e podem ser removidos.

  12. Clonagem usando o fago como vetor

  13. Vetores cosmidiais • É um híbrido entre plasmídeos e o fago labda • Vantagens: capacidade do plasmídeo de replicação autônoma • Capacidade do fago de embalagem do cromossomo • Capacidade de 35 a 45kb

  14. Estrutura de um cromossomo artificial bacteriano (BAC) usado para clonar grandes fragmentos de DNA (150 a 300kb)

  15. Construção de bibliotecas de DNA • Conjunto de clones de DNA, contendo coletivamente todo o genoma. • DNA total  digestão com enzimas de restrição  inserção em vetores

  16. Uma boa biblioteca tem todas as sequencias de DNA do genoma. • Para genomas grandes são necessários milhares de clones • O número de clones pode ser calculado: • N=(ln(1-P)/(ln(1-f) • P: probabilidade, f: fração do genoma em um clone de tamanho médio

  17. Exemplo • Drosophila genoma 100.000kb • Inserto  40kb • Probabilidade de 99% de certeza de uma seqüência estar na biblioteca: • N=(ln(1-0,99)/(ln(1-(40/100000) • N=11.513 clones

  18. Exercício • O genoma humano tem 3 bilhões de nucletídeos • Utilizando BACs: insertos de 200kb • Quantos clones são necessários para ter uma certeza de 95% de ter uma seqüência específica na biblioteca? • N=44.979

  19. Microsatélites

  20. Teste de paternidade