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DNA recombinante in a nutshell

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Presentation Transcript

  1. DNA recombinante in a nutshell

  2. Biologia Molecular Aplicada A tecnologia do DNA recombinante Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

  3. Teoria bem fundamentada • Por volta do início da década de 70, os fundamentos básicos da teoria já haviam sido propostos solidamente por Crick, Watson e C&A • Assim, os cientistas passaram a se perguntar: será que o material genético e o processo de expressão podem ser manipulados? • Ciência X (Bio)Tecnologia

  4. A descoberta da DNA ligase • 1960: recombinação de DNA ocorre em células • Reparo de danos ocorridos por luz UV • 1967, Martin Gellert • Extratos de E. coli produziam fagos lambda circulares • Purificação da DNA ligase! • Circularização de genomas

  5. Paul Berg • Reuniu o fago SV40 ao bacteriófago lambda • Queria cortar o SV40 e inserir pedaços do fago lambda nele • Usou enzimas de restrição para cortar os fagos e incubou-os juntos, utilizando DNA ligase • Criou uma técnica, segundo ele mesmo, para ligar covalentemente moléculas de DNA • Como o bacteriófago era de E. coli e esta bactéria habita nossos corpos, ele teve medo de gerar um novo e letal vírus • Posteriormente sugeriu moratória aos estudos em biologia molecular • Nobel, 1980: “por seus estudos fundamentais em bioquímica de ácidos nucléicos, particularmente com relação ao DNA recombinante” Paul Berg, 1926- Fago λ SV40

  6. Endonucleases de restrição • 1968, Paul Arber sugere a existência de enzimas existentes em bactérias que atuassem como proteção à infecção por fagos • Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios específicas • Endonuclease R • 1968 • Meselson & Yuan: EcoRI • 1970 • Smith & Kelly: nova endonuclease descoberta em H. influenzae -- HindIII • Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta DNA exógeno mas não DNA celular • Descoberta do sítio específico de corte pela enzima (AAGCTT)

  7. Mapa de restrição • 1971 - Kathleen Danna and Daniel Nathans • Ensaio de digestão: Usam a endonuclease R (EcoRI) para cortar o DNA do fago SV40 • Fragmentos tinham tamanho constante e, logo, podiam ser facilmente separados em uma eletroforese! • Verificado o fato de que a enzima corta em sítios específicos EcoRI HindIII EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI

  8. De novo, Berg Extremidades cegas • 1972, Berg’s lab • Janet Mertz and Ronald Davis descobrem que a endonuclease R1 produzia quebras espaçadas entre as duas fitas, gerando extremidades coesivas idênticas e complementares • Extremidades unidas e encubadas com DNA ligase poderiam gerar moléculas de DNA híbridas! Extremidades coesivas

  9. Ensaio de digestão • Adicione DNA + tampão + endonuclease de restrição • Deixe digerindo num banho a determinada temperatura por determinado tempo • 1 unidade de enzima de restrição digere 1 μg DNA em 1h00 • Caixa de truques do biólogo molecular contém: DNA ligase + enzimas de restrição + ...

  10. Stahen Cohen, 1936- Vetores de clonagem • ~1970: Trabalho com plasmídeos • Peças de DNA circulares e não cromossomais encontradas em bactérias • E às vezes trocadas por elas • 1970Descobriu um método segundoo qual uma E. coli adquiriria um plasmídeo conhecido como pSC101 • pSC101: contém um gene que confere resistência ao anti-biótico tetraciclina

  11. Herbert Boyer, 1936 Plasmídeo encontra Endonucleases • Cohen junta-se a Boyer, especialista em enzimas de restrição • Trabalharam com dois plasmídeos, • P1 confere resistência a tetraciclina • P2 confere resistência a kanamicina • Experimento • Corte os dois plasmídeos com enzimas de restrição • Incube-os com DNA ligase • Teste a presença de bactérias duplamente resistentes no meio • Este talvez tenha sido obtiveram o primeiro organismo recombinante feito propositalmente por um ser humano EcoRI EcoRI P1 P2 EcoRI T K Digestão + ligação K P1/2 EcoRI T

  12. Cohen & Boyer • 1973 • Inseriram genes de Xenopus laevis em E. coli e verificaram que os genes estavam ativos nas bactérias depois de várias gerações • Como as bactérias reproduziam-se rapidamente, poderiam ser utilizadas para produzir genes de grandes mamíferos em larga-escala • Constroem um organismo capaz de combinar e replicar a informação genética de diferentes espécies!

  13. O que, então, era possível fazer? • Era possível pegar o DNA de qualquer espécie, picotá-lo e inseri-lo em uma bactéria que o amplificaria milhões de vezes • A era da engenharia e da manipulação genética tem início... • Mas o que se pode fazer? Até onde podemos chegar? • Verdade seja dita: ninguém sabe ao certo...

  14. Engenharia genética • Pode-se aumentar a expressão de um gene bacteriano • Pode-se fazer bactérias produzir genes de qualquer espécie • Expressão em levedura, células de mamíferos • Produzir vírus transgênicos, produzir vírus contendo toxinas • Terapia gênica, knockout gênico • Que medo!?

  15. Discussões éticas • 1974 • Paul Berg (juntou SV40 com fago lambda ese arrependeu) alerta para o perigo da biotecnologia e sugere uma moratória • 1975 • Conferência Asilomar • Moratória de 16 meses ao DNA recombinante • Bomba atômica da biologia? • Watson acha que a natureza já fez muitos mais experimentos, por muito mais tempo e muitos mais jeitos do que podemos imaginar e nada de muito significativo aconteceu... • Se fosse causar algum dano, a natureza per se já teria causado...

  16. Joshua Lederberg • 1958, Nobel com Beadle e Tatum (um gene, uma enzima) • 1960Enquanto as discussões giravam sobre clonagem humana, sugeriu que a biotecnologia se desenvolveria através da microbiologia Lederberg defendia a terapia gênica e a engenharia de fenótipos • 1974, AsilomarDefendia a tecnologia para diagnose de doenças, medicina terapêutica, produção de proteínas humanas em larga escala, processos de fermentação, produção maciça de antibióticos • 1978, GenentechProdução da primeira insulina humana

  17. O DNA recombinante hoje • Há centenas de vetores de clonagem comerciais, cada um com vantagens específicas (encontrar promotores, descobrir interações entre genes, expressar proteína em larga escala, etc) • DNAs das mais variadas espécies são clonados a todo instante em laboratórios de biologia molecular em todo o mundo • Parece que nada de muito anormal aconteceu... Ainda... • Será que Watson está certo?

  18. Plantas transgênicas • Genes de resistência a patógenos • Resistência a inseticidas (Roundup) • Aumento da produtividade, desequilíbrio ecológico • Aumento nutricional • Adição de determinado aminoácido torna alimentos mais nutritivos • Banana vacina • Rotulação! • Prejuízo ecológico da monocultura • A maior parte do prejuízo ecológico vem da simples monocultura • A engenharia genética adiciona um nível de prejuízo ecológico ligeiramente maior • É preciso diferenciar a tecnologia de transgênicos de seu abuso pela indústria do capital • Produção de insulina, hormônio de crescimento, etc.

  19. Clonagem de genes Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

  20. Pra quê clonar genes? • Amplificar milhares de vezes apenas este gene • Realizar um estudo individual da função de genes • Identificar mutações que modifiquem a função deles • Entender a ação enzimática da proteína produzida • Verificar com quais outros genes ele interage • Produzir a proteína em larga-escala • Montar genomas completos • Produzir organismos transgênicos de interesse • Etc etc etc etc

  21. Clonagem de fragmentos de DNA • Enzimas • enzimas de restrição • DNA polimerases • DNA ligase/Topoisomerases • Fosfatases • Vetores • Plasmídios • Fagos • Cosmídeos • BACS/YACS • Vírus, bacteriófagos • Hospedeiros • Escherichia coli • Levedura • Células animais • Células vegetais

  22. Vetor plasmidial Origem de replicação Gene repórter Sítio múltiplo de clonagem

  23. Ligação do DNA exógeno ao plasmídeo • Produção da molécula de DNA recombinante • Plasmídeo + DNA cortado do organismo de interesse • Ligação das extremidades coesivas

  24. DNA Ligase • Realiza a ligação fosfodiéster • E agora, quem dirá de qual organismo é esta molécula?

  25. Clivagem do inserto clonado no vetor com enzima de restrição 1 2 PM Kb - + EcoRI 2,0 1,0 0,5 Ensaio de digestão e subclonagem

  26. Clonagem de fragmentos de DNA INSERTO: Fragmento de DNA Ligação enzimática: Ligase de DNA • VETOR ou veículo de clonagem: • -plasmídeo • -bacteriófago • -cosmídeo • cromossomo artificial de bactéria (BAC) • cromossomo artificial de levedura (YAC)

  27. Amplificação do clone em bactérias inserto fragmento de DNA ligado ao vetor construção introduzir nas células: transformação e seleção Objetivo: Obter muitas Cópias do gene pretendido bactéria transformada

  28. Transformação • Inserção do plasmídeo em bactérias • Replicação bacteriana • Produção em massa da proteína recombinante!

  29. Métodos de transformação bacteriana A transformação natural descrita por Griffiths, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro. Permeabilização com CaCl2 -- Choque térmico Eletroporação -- Choque elétrico Gene gun -- Bombardeamento • Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados pela célula bacteriana competente. • DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradação pelas enxonucleases presentes no espaço periplasmático.

  30. Será que entrei? Seleção de clones • Bactérias são colocadas em meio nutritivocom antibiótico para que cresçam e amplifiquem nosso DNA do inserto • Gene repórter • Reporta se a transformação aconteceu • Bactérias não-transformadasnão sobrevivem • Gene de resistênciaa algum antibiótico

  31. Seleção de recombinantes Durante a clonagem de fragmentos, a DNA ligase pode fechar o plasmídeo sem que nenhum inserto tenha sido clonado. Para evitar a análise de um vetor fechado é preciso um novo teste de gene repórter.

  32. Keywords • Conceitos-chave para a tecnologia do DNA recombinante: • Vetor • Sítio múltiplo de clonagem • Genes repórteres • Inserto • Endonucleases de restrição sítio-específicas • Digestão, ligação, clonagem http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o&feature=related

  33. Material Suplementar • Várias técnicas de biomol podem ser escolhidas aqui para a realização do trabalho de fim de curso: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/ • http://www.nature.com/milestones/miledna/timeline.html • http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_biotechnology • http://www.nature.com/scitable/topicpage/Recombinant-DNA-Technology-and-Transgenic-Animals-34513 • http://www.nature.com/scitable/topicpage/Restriction-Enzymes-545