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Inducción de proteína recombinante

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  1. Inducción de proteína recombinante Antecedentes y experimento

  2. ¿Para que nos sirve la Tecnología de DNA recombinante? Para el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro ¿Cómo hacerlo ?

  3. Esquema para la producción de proteína recombinante Producción del vector recombinante. (Vector y DNA cortado con enzimas de restricción y su posterior ligación) Transfomación de células de E. coli Células de E. coli transformantes creciendo en el medio IPTG Inducción de proteína recombinante 3

  4. Hasta donde vamos con la producción de células transformantes? • Comprobamos fenotípicamente que las células tengan el vector recombinante. Crecimiento en medio de selección para kanamicina. • Comprobamos que contenga el inserto, mediante la restricción del plásmido y nos FALTA • Comprobar que se produzca la proteína para la cual codifica el gen de interés.

  5. Objetivos de la inducción de proteína recombinante Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli. Realizar la inducción de una proteína recombinante (-lactamasa). Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante. Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante. Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes.

  6. ¿Qué proteínas se pueden producir con la tecnología del RNA recombinante? • De todo tipo, proteínas membranales, proteínas solubles, proteínas de bajo o de alto peso molecular • Pero, dependiendo de la proteína a expresar necesitamos un tipo particular de vector en el que se introduce el gen de interés.

  7. Vectores de expresión para producción de proteínas recombinantes • La función de un vector de expresión es llevar a la formación del producto del gene, usualmente más del producto mejor. • Por lo tanto los vectores de expresión tienen promotores muy fuertes, • Esto quiere decir que entre más RNAm producido más proteína se obtendrá.

  8. VECTORES DE EXPRESIÓN INDUCIBLE • Generalmente es ventajoso mantener al gene recombinante o transgen reprimido hasta que se este listo para expresar en la célula huésped. • Esto es porque las proteínas eucarióticas producidas en gran escala pueden ser tóxicas para las bacterias e interferir con el crecimiento bacteriano. • Entonces la solución es mantener el gene clonado en la bacteria APAGADO. • ¿Cómo apagamos el gen? • Colocándolo debajo de un promotor inducible que puede mantenerlo apagado. Un ejemplo es el del operón lac

  9. Vector con inserto o Tenemos al inserto en negro Con un cuadro la región (secuencia) del operador (O) Lac I la secuencia que codifica para la proteína represora (parte del sistema de regulación del operón lac)

  10. El operón lac consta de tres genes estructurales (lacZ, lacY, y lacA), que codifican enzimas metabólicas implicados en la utilización de la lactosa como fuente de carbono. • Lac I codifica para una proteína represora • Operador es una secuencia a la que de manera específica se puede unir la proteína represora. • En presencia de una molécula que se une a la proteína represora se reprime la expresión de los genes

  11. El inductor del operón lac que utilizaremos será el isopropiltiogalactósido (IPTG). El IPTG suele utilizarse como inductor artificial del operón lac, ya que es capaz de unirse al represor LacI (es decir a la proteína represora), pero no es un sustrato para la β-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria. En presencia de una molécula como lactosa o un análogo se forma un complejo con la proteína represora y entonces el complejo no se une al operador y entonces la RNA polimerasa transcribe el gene.

  12. No transcripción del TRANSGENE: Cuando al sintetizarse la proteína represora (lac repressor) va y se une a la región del operador. Entonces no hay transcripción transgene porque se impide la unión de la RNA polimerasa. INDUCCIÓN Cuando hay inductor como el IPTG, se forma el complejo IPTG-represor y entonces la RNA polimerasa transcribe al transgene. Entonces, como se lleva a cabo la inducción de la proteína recombinante?

  13. Como funciona la lactosa o el IPTG A) células que expresan el promotor de lactosa completo producen la -galactosidasa B) vector recombinante en donde se usa parte del promotor de lactosa para producir proteína recombinante.

  14. El experimento Medio saturado Inocular una alícuota en medio fresco. Alcanzar la absorbancia en donde las células se encuentren en la fase log Añadir el inductor Tomar alícuotas (curso temporal de inducción de proteína recombinante Separación y visualización en un gel de poliacrilamida-SDS Determinación del tiempo óptimo de inducción

  15. ¿Qué esperamos? Tiempo de inducción 0 0.5 1.0 1.5 Std Proteína recombinante Teñido con la solución de Coomasie 0.12% azul de coomasie R250 50% Metanol 10% ácido acético Desteñido con: 45% Metanol 10% ácido acético