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Tecnologia do DNA Recombinante

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Tecnologia do DNA Recombinante

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  1. Tecnologia do DNA Recombinante • Enzimas de Restrição (endonucleases): tesouras do DNA • enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de vírus invasores; • diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de bases de DNA; • reconhecem e clivam o DNA em pontos específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases – palíndromas. • Nomenclatura: as enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria que a produziu: • Izosquizomeros: diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma sequência de reconhecimento Tecnologia do DNA recombinante

  2. -3’ coesiva = EcoRI = 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ “cega” = SmaI = • Extremidades: coesivas X “cegas” Tecnologia do DNA recombinante

  3. Cortando e Juntando o DNA.... Tecnologia do DNA recombinante

  4. Amplificação do DNA recombinante.... Tecnologia do DNA recombinante

  5. Escolha de um vetor de clonagem: • molécula pequena – fácil manipulação • capaz de se replicar em uma célula viva • presença de sítios de restrição para inserção do DNA a ser clonado • possuir um método de identificaçãoe recuperação das moléculas recombinantes Ex: pUC18 ampR - bactérias transformadas serão resistêntes a ampicilina popiligador – sítio de clonagem múltipla lacZ’ - codifica para –galactosidade que converte X-Gal em um corante azul Tecnologia do DNA recombinante

  6. Construção de uma biblioteca de DNA • Construção de uma biblioteca de cDNA • cDNA = DNA complementar; • feito a partir do mRNA; • não tem introns Tecnologia do DNA recombinante

  7. Uso do DNA clonado como sonda • transferência de Southern (E.M. Southern) - DNA • transferência de Northern- RNA • transferência de Western - PTN Tecnologia do DNA recombinante

  8. Mapas de Restrição • É uma compilação do número, da ordem e da distância entre locais do corte da enzima de • restrição ao longo de um segmento de DNA • As unidades do mapa são expressadas em pares de bases ou para distâncias mais longas em pares de kilobases • O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vetor bem caracterizado do plasmídeo ou do bacteriófago, onde a sequência é conhecida • Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um DNA desconhecido e um pré-requisito para manipulá-lo para outras finalidades. Tecnologia do DNA recombinante