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DNA RECOMBINANTE E INGIENIER Í A GEN É TICA

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  1. DNA RECOMBINANTE E INGIENIERÍA GENÉTICA

  2. INGENIERÍA GENÉTICA MANIPULACIÓN DEL DNA DE LOS ORGANISMOS VIVOS 1) INVESTIGACIÓN BÁSICA (ESTUDIO DE LA ORGANIZACIÓN, EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE GENES EN LOS ORGANISMOS VIVOS). 2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN LA MANIPULACIÓN CONSCIENTE DE LOS GENES EN SALUD, EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS, EN LA AGRICULTURA, ETC.

  3. PIEDRAS ANGULARES DE LA INGIENIERÍA GENÉTICA • CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS • DE cDNA Y GENÓMICAS • DESCUBRIMEINTO DE LAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (ENZIMAS DE RESTRICCIÓN) • DESCUBRIMIENTO DE LA REACCIÓN • DE POLIMERIZACIÓN DE CADENA O • PCR (POLYMERASE CHAIN REACCTION)

  4. Técnicas de DNA Recombinante

  5. El problema: ¿Qué material genético vamos a manipular y cómo lo vamos a hacer?

  6. ANALISIS DE GENES • Aislar secuencias de DNA • Obtener múltiples copias de ellos TECNICAS • Clonamiento Molecular • PCR (reacción en cadena de la polimerasa) Se requiere:

  7. CLONAMIENTO MOLECULAR • HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción • Vectores • DNA ligasa • Células huésped *

  8. Enzimas de Restricción

  9. DIGESTION DEL DNA POR ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Sitio de corte

  10. ENZIMAS de RESTRICCION ES Sitios de corte de endonucleasas de restricción Sitio de corte de enzimas de restricción Las flechas indican los enlaces fosfodiester sobre los que actúa cada enzima

  11. CLONAMIENTO MOLECULAR • HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción • Vectores • DNA ligasa • Células huésped

  12. Características básicas de un vector de • clonamiento • Origen de replicación autónomo • Gen marcador de selección • Sitios únicos de restricción

  13. Componentes básicos de un vector de clonamiento plasmidial que puede replicar en una célula de E.coli codifica proteína de resistencia a ampicilina Región de inserción de DNA Exógeno Origen de replicación Caja de clonaje múltiple

  14. ¿PORQUE EL USO DE UN VECTOR ? 1ª división celular 2ª división celular

  15. TIPOS DE VECTORES kpb inserto Plasmidios 3-5 bacteriofagos 15 BACS 300 YACS 2000

  16. CLONAMIENTO EN PLASMIDIO Sitio de corte Sitio de corte DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII EcoRI PvuII Extremos cohesivos Extremos romos Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII

  17. CLONAMIENTO MOLECULAR • HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción • Vectores • DNA ligasa • Células huésped

  18. Unión de fragmentos de restricción que poseen extremos cohesivos Fragmentos de DNA genómico b + c

  19. CLONAMIENTO EN PLASMIDIO Sitio de corte Sitio de corte DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII EcoRI PvuII Extremos cohesivos Extremos romos Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII

  20. CLONAMIENTO MOLECULAR • HERRAMIENTAS BASICAS • Enzimas de restricción • Vectores • DNA ligasa • Células huésped

  21. PROPAGACION EN CELULA HUESPED

  22. RESUMEN DE CLONAMIENTO Enzimas de restricción DNA Ligasa Vector Célula huésped

  23. CLONES que contienen diferentes fragmentos del genoma = GENOTECA

  24. GENOTECAS O LIBRERÍAS CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS DE cDNA Y DE DNA GENÓMICO USO DE VECTORES -PLASMIDIOS -DNAs DE FAGOS -OTROS (BACs, COSMIDIOS, YACs, ETC).

  25. Genoteca de cDNA • Obtención : • Clonamiento de cDNA obtenido mediante transcripción reversa de mRNA total.

  26. vectores ligación + transformación

  27. Genoteca de DNA genómico Obtención : 1.Fragmentación de todo el genoma mediante enzimas de restricción 2. Clonamiento de fragmentos en vectores

  28. ¿Cómo aislar un fragmento de DNAde interés? Aislamiento de un clon -Uso de sondas radiactivas - PCR

  29. Identificación de un fragmento de DNA específico en las colonias transformadas mediante HIBRIDIZACION CON SONDAS MARCADAS

  30. Clonamiento por PCR

  31. libreria CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR

  32. Combinación de la transcripción reversa con PCR RT-PCR

  33. Cloning by RT-PCR TTTTTTT PCR cDNA Corte con enzimas de restricción y ligación a un plasmidio

  34. libreria CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR

  35. SECUENCIACION DEL DNA

  36. Estudio de la función de un gen Vectores de expresión

  37. Vector de expresión en bacterias

  38. Vectores de expresión en eucariotes

  39. FUNCIÓN DE UN GEN • Herramientas de Estudio: • Análisis computacional en banco de datos: homología de secuencia con un gen de otro organismo cuya función se conoce. • Animales transgénicos y knock out.