p edn ky z l ka sk biofyziky masarykova univerzita v brn biofyzik ln centrum n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
P?ednášky z léka?ské biofyziky Masarykova univerzita v Brn? - Biofyzikální centrum PowerPoint Presentation
Download Presentation
P?ednášky z léka?ské biofyziky Masarykova univerzita v Brn? - Biofyzikální centrum

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 47

P?ednášky z léka?ské biofyziky Masarykova univerzita v Brn? - Biofyzikální centrum - PowerPoint PPT Presentation


  • 171 Views
  • Uploaded on

Přednášky z lékařské biofyziky Masarykova univerzita v Brně - Biofyzikální centrum. Úvod do molekulární biofyziky II. Struktura biopolymerů. Studium struktury biopolymerů a jejich komplexů např. umožňuje pochopit: Specificitu enzymatických a imunologických reakcí

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'P?ednášky z léka?ské biofyziky Masarykova univerzita v Brn? - Biofyzikální centrum' - gibson


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
p edn ky z l ka sk biofyziky masarykova univerzita v brn biofyzik ln centrum

Přednášky z lékařské biofyzikyMasarykova univerzita v Brně - Biofyzikální centrum

Úvod do molekulární biofyziky II

struktura biopolymer
Struktura biopolymerů
  • Studium struktury biopolymerů a jejich komplexů např. umožňuje pochopit:
    • Specificitu enzymatických a imunologických reakcí
    • Účinky některých léčiv (cytostatik) na molekulární úrovni.
    • Mechanismy transportních procesů
    • Buněčný pohyb
    • ……………..
metody zalo en na m en mechanick ch vlastnost
Metody založené na měření mechanických vlastností
  • Velikost a tvar makromolekul lze studovat měřením:
    • osmotického tlaku
    • difuzního koeficientu
    • viskozity (tvaru molekul)
  • Zjištění poloměru částic:
    • Měření rychlosti sedimentace
  • Zjištění velikosti a částečně i tvaru:
    • TEM
    • chromatografie - molekulově-síťový efekt (gelová permeační chromatografie)
    • elektroforetická pohyblivost bílkovin (dodecylsulfát sodný se definovaně váže k bílkovině a eliminuje její vlastní elektrický náboj, přičemž nese jeden náboj záporný).
b metody zalo en na m en interakce s elektromagnetick m z en m
B) Metody založené na měření interakce s elektromagnetickým zářením
  • Absorpční spektrofotometrie.
    • VIS
    • IR
    • UV

Speciální metody

  • Ramanova spektrometrie.
druhy spektrofotometr
Druhy spektrofotometrů
  • Spektrofotometry jsou laboratorní přístroje používané pro měření koncentrace látek absorbujících nebo emitujících infračervené, viditelné nebo ultrafialové světlo. Mohou být též použity pro studium jejich chemické struktury.
  • Absorpční spektrofotometry: založeny na spektrální závislosti absorpce světla.
  • Emisní spektrofotometry: Zdrojem světla je sama analyzovaná látka, jež je injektována nebo rozprašována do bezbarvého plamene. Emitované světlo prochází optickým hranolem nebo mřížkou, takže můžeme získat celé emisní spektrum. Frekvence přítomné ve spektru umožňují identifikovat např. přítomné ionty.
  • Spektrofluorimetry: emise světla je vyvolána světlem o vlnové délce kratší než je vlnová délka světla emitovaného.
absorp n spektrofotometry lambert v beer v z kon
Absorpční spektrofotometry: Lambertův-Beerův zákon

Absorpční spektrofotometrie je založena na absorpci světla při průchodu vrstvou roztoku. Jeho koncentrace může být zjištěna pomocí Lambertova-Beerova zákona:

I = I0.10-ecx

c je koncentrace rozpuštěné látky, x tloušťka vrstvy, I0 původní intenzita světla, I je intenzita světla po průchodu vrstvou. Konstanta e (epsilon, absorpční nebo extinkční koeficient) závisí na vlnové délce světla, na rozpuštěné látce a rozpouštědle. Její hodnoty pro běžné chemické sloučeniny lze nalézt v tabulkách. Tyto hodnoty jsou vždy udávány pro určitou vlnovou délku (obvykle absorpční maximum). Číselné hodnoty tohoto koeficientu závisejí na tom, jak je vyjadřována koncentrace rozpuštěné látky. Když použijeme mol.l-1, hovoříme o molárním absorpčním koeficientu.

slide8
Poměr intenzit světla prošlého a dopadajícího se nazývá transmitance (dříve transparence). Dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance se nazývá absorbance A.

S ohledem na L.-B. zákon je tedy absorbance přímo úměrná koncentraci rozpuštěné látky a tloušťce absorbující vrstvy roztoku.

A = e.c.x

druhy absorp n ch spektrofotometr
Druhy absorpčních spektrofotometrů
  • Podle konstrukce rozdělujeme spektrofotometry na jednopaprskové a dvoupaprskové.
  • U jednopaprskových spektrofotometrů jeden svazek světla prochází nejdříve srovnávacím a pak měřeným vzorkem (kyvety obsahující roztoky musí být pohyblivé). U dvoupaprskových spektrofotometrů jeden svazek světla prochází měřeným vzorkem a druhý srovnávacím vzorkem (blankem). Dvoupaprskové přístroje umožňují podstatně rychlejší měření, avšak jsou dražší. U jednoduchých přístrojů je nastavování vlnové délky světla ruční. U pokročilejších přístrojů se toto nastavování děje automaticky, což umožňuje přímo získávat absorpční křivky, tj. grafy závislostí absorbance na vlnové délce světla.
slide10

Jednopaprskový spektrofotometr

Zdrojem světla (1) je žárovka s wolframovým vláknem. Její polychromatické světlo prochází kondenzorem (2) a odráží se od zrcadla (3) na vstupní štěrbinu (4) monochromátoru (části 4 až 8, plus 12). Světlo je soustřeďováno čočkou (5) na odrazovou optickou mřížku (6), která tvoří barevné spektrum. Téměř monochromatické světlo je promítáno objektivem (7) na výstupní štěrbinu (8) monochromátoru.

slide11

S mřížkou lze otáčet pomocí ovladače vlnových délek (12), čímž se zaměřuje světlo o určité vlnové délce na výstupní štěrbinu. Svazek světla pak prochází kyvetou (9) se vzorkem. Intenzita prošlého světla je měřena fotodetektorem (10, 11). Jeho signál je zesilován zesilovačem (13). Hodnota absorbance je zobrazena na displeji (14). Intenzita světla prošlého srovnávacím roztokem je vždy srovnávána s intenzitou téhož svazku světla prošlého měřeným vzorkem.

slide12

NIR = near infrared = blízká infračervená oblast

Moderní UV/VIS/NIR spektrofotometr

Světlojedné vybrané vlnové délkynebocelé prošlé spektrummůže být měřeno

dal optick metody
Další optické metody
  • Absorpční spektrofotometrie v UV oblasti.
    • Tryptofan a tyrosin mají absorpční maximum kolem 280 nm. Fenylalanin při 255 nm.
    • Nukleotidy (dusíkaté báze) - absorpční maxima při 260 - 270 nm.
    • Chromofory - jejichabsorpční vlastnosti se mění v závislosti na chemickém okolí.
absorp n spektra aminokyselin
Absorpční spektra aminokyselin

Podle: http://www.gwdg.de/~pdittri/bilder/absorption.jpg

slide15

Tryptofan je přirozeným chromoforem – obr. ukazuje zhášení jeho fluorescence v závislosti na koncentraci 9-cis-retinalu. Jde o vliv této látky na bílkovinu potřebnou k regeneraci rodopsinu.http://www.molvis.org/molvis/v4/a33/nickerson-fig2.html

hypochromn efekt he
Hypochromní efekt (HE).
  • Absorpce světla ovlivňována dipólovým momentem vazeb, se kterými interaguje. Jsou-li dipóly paralelní, vzájemně se ovlivňují a snižuje se poněkud jejich schopnost absorbovat energii fotonů. U bílkovin se HE projevuje u peptidových vazeb, které mají absorpční maximum v UV kolem 190 nm. Jsou-li dipólové momenty těchto vazeb náhodně uspořádané (denaturovaná bílkovina), absorbují světlo lépe než ve stavu s pravidelnými strukturami.
  • Helicita - poměrné zastoupení uspořádaných částí makromolekuly. Dvoušroubovice DNA absorbuje UV méně než neuspořádaná (denaturovaná) molekula.
slide17

Hypochromní efekt u kyseliny polyglutamové. Při pH 7 vytváří statistické klubko (1), při pH 4 má šroubovicovou strukturu (2). Absorpční maximum peptidových vazeb je pak sníženo vlivem jejich prostorového uspořádání. e je molární absorpční koeficient a l je vlnová délka UV záření. Dle Kalouse a Pavlíčka, (1980).

optick rota n disperze
Optická rotační disperze
  • Měření optické aktivityi absorpce polarizovaného světla. Při konformačních změnách molekul se mění stavba molekul, což lze polarimetricky sledovat
  • Přesnější: Optická rotační disperze (ORD) - závislost optické otáčivosti na vlnové délce světla. Lze získat údaje o zastoupení a-šroubovic či poměrném zastoupení a-šroubovic a b-struktur.
  • Nakonec byla tato metoda nahrazena citlivější metodou cirkulárního dichroismu (CD)
cirkul rn dichroismus
Cirkulární dichroismus

Obdobné informace: metoda cirkulárního dichroismu (CD) - porovnávána absorbance levotočivě a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla v oblasti absorpčního maxima

Podobné využití mají tyto metody i při studiu struktury NK.

Obrázek ukazuje změny elipticity syntetického polypeptidu s dlouhými úseky poly-glu po různém přídavku trifluoroetanolu (TFE), který zvyšuje zastoupení a-helixu. http://www-structure.llnl.gov/cd/polyq.htm

ramanova spektrometrie
Ramanova spektrometrie

Rayleighův rozptyl světla. Nastává interakcí fotonů s molekulami, jež se projeví jen velmi malou nebo žádnou změnou vlnové délky. Intenzita rozptýleného světla závisí na molekulové hmotnosti a také na úhlu rozptylu, což lze využít pro odhad tvaru makromolekul.

Při rozptylu světla dochází k malé změně vlnové délky rozptýleného světla, způsobené malým pohlcením či zvýšením energie rozptylovaných fotonů při přechodech mezi vibračními a rotačními stavy molekul. Ty se mění při změnách struktury molekul - změny Ramanových spekter proto odrážejí změny struktury molekul.

ramanova spektrometrie1
Ramanova spektrometrie

Ramanovo spektrum polytenního chromosomu rodu Chironomus. Při vybraných vlnočtech lze s výhodou realizovat Ramanovu mikroskopii. Vybuzeno laserovým světlem o vlnové délce 647.1 nm

Podle: http://www.ijvs.com/volume2/edition3/section4.htm

slide22

Mikroskopický snímek v normálním bílém světle

  • (chromosom Chironomus Thummi Thummi)

Konfokální ramanovský snímek zobrazující páteř DNA (vibrace při 1094 cm-1

  • Konfokální ramanovský snímek zobrazující přítomnost alifatických řetězců v bílkovinách chromosomu při 1449 cm-1
  • Zdroj jako předchozí
ir spektrofotometrie
IR spektrofotometrie
  • Infračervené záření (IR) působí na rotační a vibrační stavy molekul. Složité molekuly mohou vibrovat nebo rotovat mnoha různými způsoby (módy).Různé chemické skupiny (-CH3, -OH, -COOH, -NH2atd.) mají specifické vibrační a rotační frekvence, a proto absorbují IR světlo o specifických vlnových délkách.
  • Z tohoto důvodu mají infračervená absorpční spektra mnoho maxim. Změna chemické struktury se projevuje jako změna polohy těchto maxim ve spektru.
infra erven vibra n spektrum hexanu http www columbia edu cu chemistry edison irtutor html
Infračervené vibrační spektrum hexanuhttp://www.columbia.edu/cu/chemistry/edison/IRTutor.html
slide25
Informace o sekundární a terciární struktuře bílkovin či NK poskytují i:
    • metody elektrochemické(studuje se interakce makromolekul s elektrodami)
    • nukleární magnetická resonance(umožňuje určit chemické okolí studovaných atomů),
    • elektronová spinová resonance aj.
rentgenstrukturn anal za
Rentgenstrukturní analýza
  • Krystalová mřížka působí na rtg záření jako optická mřížka. Dochází k ohybovým jevům a vzniku interferenčních obrazců. Tyto obrazce lze matematicky analyzovat a získat tak informaci o rozložení elektronů v molekulách tvořících krystal.

http://cwx.prenhall.com/horton/medialib/media_portfolio/text_images/FG04_02aC.JPG

slide28

Krystalogram B-DNA získaný v r. 1952 Rosalindou E. Franklinovou, na základě kterého předložili Watson a Crick model dvoušroubovicové struktury DNA

F

C

W

nov mikroskopick techniky
Nové mikroskopické techniky
  • optická skanovací mikroskopie v blízkém poli(near-field optical scanning microscopy, NFOS - Near-field Scanning Optical Microscopy, NSOM, SNOM)

Schéma optického skanovacího mikroskopu pro pozorování v blízkém poli. Otvorem v kovovém obalu skleněného hrotu, který má průměr 5 - 10 nm, prochází úzký paprsek světla argonového laseru. Preparát (tenký řez) se pohybuje nad otvorem. Kontrola vzdálenosti preparátu pomocí tunelového efektu. Zpracováno podle Rontó a Tarjána (1994).

slide30

Plasmidová DNA – 10kb

  • http://www.snom.omicron.de/examples/twinsnom/x-tsnom_12.html

Hrot propouštějící světlo pozorovaný v normálním optickém mikroskopu

  • http://physics.nist.gov/Divisions/Div844/facilities/nsom/nsom.html
nov mikroskopick techniky1
Nové mikroskopické techniky

AFM – Atomic force microscopy – jemný hrot sleduje nerovnosti povrchu

http://physchem.ox.ac.uk/~rgc/research/afm/afm1.htm

nov mikroskopick techniky2
Nové mikroskopické techniky

AFM – Atomic force microscopy

Plazmidová DNA – 10 kb,

  • http://www.snom.omicron.de/examples/twinsnom/x-tsnom_12.html

Krystalická struktura křemíku – atomové rozlišení

  • http://www.omicron-instruments.com/ products/afm_stm/r_afmst6.html
dna zobrazen pomoc afm http spm phy bris ac uk research dna images dna2 jpg
DNA zobrazená pomocí AFM -http://spm.phy.bris.ac.uk/research/DNA/images/dna2.jpg
nov mikroskopick techniky3
Nové mikroskopické techniky
  • skanovací tunelová elektronová mikroskopie(scanning tunnelling electron microscopy, STM).

Zjednodušené schéma elektronového skanovacího tunelového mikroskopu (STM). Nahoře celkové schéma přístroje, dole detail snímací kovové jehly, která svým pohybem kopíruje povrch vzorku. Jehla je nabita kladně. Zpracováno podle Rontó a Tarjána (1994).

nov mikroskopick techniky4
Nové mikroskopické techniky

skanovací tunelová elektronová

mikroskopie - STM.

Nápis IBM vytvořený z atomů xenonu na niklové podložce http://www.almaden.ibm.com/vis/stm/images/stm10.jpg

Rozštěpené a nerozštěpené kruhy plasmidové DNA

  • http://www.sci.port.ac.uk/spm/overfig5.htm
probl m
Problém
  • Nelze obecně předpokládat, že struktura bílkoviny v krystalickém stavu, v roztoku a in situ je identická. Bílkoviny jsou někdy aktivní jen jako integrální součásti jiných struktur. Struktura NK bude ovlivňována interakcí s bílkovinami. Lokální změnu struktury DNA vyvolávají i látky, které se mohou vmezeřit (interkalovat) mezi paralelně uspořádané báze v dvoušroubovici.
metody separace koloid a hrub ch disperz
Metody separace koloidů a hrubých disperzí

Pomíjíme chromatografii a chemické metody.

Dva cíle:

  • Separacedisperzního prostředí a disperzního podílu.
  • Rozdělení (frakcionace)polydisperzních systémů na složky.
  • Příklad: analýza krevní plazmy, mozkomíšního moku aj.

a) Ultrafiltrace.

  • Membrána propouští jen rozpouštědlo a malé molekuly. Na koloid je nutno působit zvýšeným tlakem, který překonává jeho onkotický tlak a urychluje přestup rozpouštědla na druhou stranu membrány - velmi šetrná metoda.
  • Chceme-li z koloidu odstranit pouze nízkomolekulární příměsi, ne však rozpouštědlo, lze použít dialýzu.
  • Dialyzační princip se uplatňuje i v umělé ledvině.
metody separace koloid a hrub ch disperz1
Metody separace koloidů a hrubých disperzí
  • b) Sedimentace
  • K jejímu urychlení se používají centrifugy (ultracentrifugy, až několika set tisíc ot./min, až miliony g).
  • Sedimentační rychlost závisí na rozdílu hustot částic a prostředí, na jejich velikosti a tvaru. Hlavně se uplatňují tři síly:
  • 1) Vztlakovádle Archimedova zákona:

F = (r - r').V.a = (r - r').V.r.w2

kde ra r' jsou hustoty částic a rozpouštědla, V objem částice, a odstředivé zrychlení, r poloměr otáčení, wúhlová rychlost.

slide39
2) Odstředivá:

F = mef.r.w2

kde mef je tzv. efektivní hmotnost: mef = V(r - r')

  • 3) Odporu proti pohybu tělesa v kapalině (Stokesův vzorec)

F = 6.p.r.h.v

kde r je poloměr částice, hdynamická viskozita, v rychlost pohybu částice vůči kapalině.

slide40

Sedimentaci částic charakterizujeme pomocí sedimentačního koeficientu s [s]:

Okamžitá rychlost je derivací dráhy podle času, v = dr/dt (částice se pohybuje ve směru r, takže po vynásobení čitatele i jmenovatele ve vzorci výrazem w-2 napíšeme:

slide41
Po separaci proměnných a integraci získáváme rovnici:

ln r = s.w2.t + konst.

s je obsaženo ve směrnici závislosti přirozeného logaritmu r na čase. Tento graf lze získat proměřováním polohy částice r během sedimentace.

  • Sedimentační koeficient menších molekul bílkovin - 10-13 s.
  • Jednotka sedimentačního koeficientu:

svedbergS ( = 1.10-13 s).

  • Zviditelnění sedimentujících látek: měřením absorpce UV záření nebo indexu lomu.
slide42
Sedimentační koeficient s závisí na molekulové hmotnosti M dle Svedbergova vzorce:

kder je hustota prostředí, rb hustota molekul, NA Avogadrova konstanta a f tzv. frikční neboli hydrodynamický koeficient.

Hustota makromolekul se měří pyknometricky, hydrodynamický koeficient měřením difuze.

sedimenta n anal za
Sedimentační analýza
  • K rozdělení polydisperzního koloidu dochází vlivem různě rychlého odstředivého pohybu jednotlivých složek (frakcí). Dvě možnosti:
  • 1) Analyzovaným koloidem se převrství čisté rozpouštědlo. Po určité době odstřeďování se zjišťuje poloha jednotlivých složek koloidu v rozpouštědle - zónová sedimentace.
  • 2) Sedimentace v hustotním gradientu - v kyvetě se intenzívním odstřeďováním připraví hustotní gradient vhodné látky (např. CsCl). Pohyb sedimentující složky se zastaví tam, kde vztlaková síla bude stejná jako síla odstředivá.
  • Důkaz tzv. semikonzervativního modelu replikace DNA.
slide44

Analytická ultra-centrifugaschéma podle:http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/geerlof/draft_frames/flowchart/Characterization/AUC/auc.html#Why Analytical Ultracentrifugation

m en membr nov ch potenci l
Měření membránových potenciálů
  • Membránové potenciály se měří s pomocí skleněných mikroelektrod, tj. skleněných kapilár s velmi jemnou úzkou špičkou. Průměr otvoru na konci špičky musí být menší než 1 mm, aby nedošlo při zavádění do buňky k jejímu významnému poškození. Vnitřní prostor špičky kapiláry je naplněn roztokem KCl o koncentraci 3 mol.l-1. Jako elektroda srovnávací se používá elektroda stříbrochloridová umístěná do mimobuněčného prostoru.
  • Pro skleněné mikroelektrody je charakteristický vysoký vnitřní odpor (kolem 10 MW), takže potřebujeme pro měření vysoce kvalitní zesilovače, abychom zamezili zkreslení měřeného napětí.
experiment ln uspo d n pro m en membr nov ch potenci l kapil rn mi mikroelektrodami
Experimentální uspořádání pro měření membránových potenciálů kapilárními mikroelektrodami

Pomocí skleněných mikroelektrod lze také měřit jiné elektrochemické parametry buněk a membrán, např. koncentraci některých iontů. Mohou být připraveny jako elektrody iontově selektivní pro Na+, K+, Ca2+, H+ …

metoda p atch clamp ter kov z mek
Metoda patch-clamp („terčíkový zámek“)

Tupá skleněná mikroelektroda se přiloží k povrchu buňky nebo k části biologické či umělé membrány.Otvor na konci mikroelektrody je zcela uzavřen „terčíkem“ membrány a měřená elektrická napětí nebo proudy se proto týkají jen malého okrsku membrány, v němž se nalézá jen malý počet iontových kanálů.

Některé iontové kanály mohou být předem uzavřeny nebo otevřeny, náplň mikroelektrody může obsahovat ligandy, schopné interagovat s iontovými kanály, a všeobecně jakékoliv látky, jež mohou ovlivňovat funkci membrány.Tato metoda umožňuje studium aktivity jednotlivých iontových kanálů nebo jejich malých skupin.