目的基因的原核诱导表达及 SDS-PAGE 凝胶电泳

1. 现代分子生物学大实验 目的基因的原核诱导表达及SDS-PAGE凝胶电泳

2. 实验目的 • 重点掌握表达载体构建的原理及方法 • 掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法 • 了解目的蛋白质 “标签”纯化的基本原理和方法 • 掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法 • 掌握考马斯亮蓝染色的方法

3. 实验原理 • 目的蛋白质的诱导表达 • 目的蛋白质的纯化 • 目的蛋白质的检测

4. 实验原理 • 蛋白质的表达：将克隆基因插入合适载体后导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法。 • 体内很难分析单个蛋白质的作用 • 进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究 • 应用于蛋白纯化、定位及功能分析等方面

5. 例 图 pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16 peptides 融合蛋白 在Hela细胞中的荧光显微镜检测（×400）

6. 实验原理 原核细胞表达系统真核细胞表达系统 • 酵母表达系统 • 昆虫表达系统 • 哺乳动物细胞表达系统 • 表达的蛋白具有正常的活性、构象 • 技术难度较大、耗时、耗资 • 大肠杆菌表达系统 • 实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备 • 不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工，易形成包涵体

7. 实验原理 • 原核细胞表达系统菌株 • 菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。 • 堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。 • 大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。

8. 多克隆位点 Tag Promoter Plasmid Ampr lacIq 实验原理 • 原核表达质粒的构建 • 目的基因 • 表达载体

9. 实验原理 • 目的基因/ DNA / PCR / 酶切 / Primer • 例： • p38中抑制多肽16肽序列 • GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC • F 5’-ACG GAT CC TA GGA AGA ACA TTG TTT CCTGGT-3’ • R 5’-ACG GAT CC TTA GAG CTT CAA CTG ATC AAT ATG G-3’ • 5’端引物中AC是随机保护碱基，G GAT CC是BamH I酶切位点，TA是为防止移码而引入的两个碱基，随后是编码16肽前7个氨基酸的碱基序列。 • 3’端引物中AC是随机保护碱基，G GAT CC是BamH I酶切位点，TAA是终止密码子的反向互补序列，随后是从编码16肽碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列。

11. 实验原理 • 表达载体 • 能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。 • 元件 • 启动子、终止子、核糖体识别序列 • 诱导性表达所需要的元件 • 操纵子序列 • 调控基因 • 多克隆位点 • 融合Tag • 复制起始序列 • 筛选标记/报告基因 • 各种表达载体的不同之处 在于其表达元件的差异。

12. 实验原理 启动子、终止子、核糖体识别序列 • 启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子， • 转录终止子 • 核糖体结合位点 操纵子序列及配套的调控基因 • 诱导性表达所需要的元件 多克隆位点复制起始序列

13. 实验原理 • 用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （Tag）。 • 标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端，能够与目的基因融合表达（N端或者C端融合表达）。 • 目前常用的标签有 • 组氨酸标签（His-Tag） • 谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase）标签（GST-Tag） • 硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）标签 • 麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP） • 蛋白质 A（protein A） • 纤维素结合位点（cellulose binding domain）标签等。 • 一般对于小分子用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag（如His）减少对目的蛋白的影响。

14. 实验原理 • 筛选标记/报告基因表达 • 抗药性基因，Amp是最常见的筛选标记，kana，新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。 • 抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。 • GFP（绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因了，半乳糖苷酶，荧光素酶。 • 一些融合表达Tag也有报告基因的功能。

15. 实验原理 • 常用表达载体 • pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白表达系统的载体。 • Ptac Promoter • Amp • pGEX - KG • pET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。 • T7 • Kana • pET - 14b

17. 实验原理 • 目的蛋白质的诱导表达 • lacI q（Lactose） • lacI是大肠杆菌中lac 操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是lac 操纵基因（Operator）的抑制因子，抑制转录启动。 • 当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac 操纵子上的结构基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以正常表达，启动转录。 • IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此IPTG经常作为lac 操纵子的诱导剂而使用。

18. 多克隆位点 GST Ptac Promoter IPTG Plasmid pGEX-KG AmpR Ampr lacIq 实验原理

19. cDNA Nde I • BamH I Nde I BamH I 基因片段 酶切 酶切 酶切后的目的基因 连接 筛选（蓝白斑） 转化 原核表达质粒的构建成功 鉴定（PCR、酶切、测序）

20. 实验原理 • 原核表达的诱导条件 • IPTG浓度： 0.01-5mmol/L • 诱导时间：～3h • 诱导温度：15-42℃

21. 实验原理 • 目的蛋白质的纯化 • 破碎细胞 • 超声破碎 • 溶菌酶裂解 • 从细胞蛋白中纯化出GST和His融合蛋白 • GST可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。由于GST对谷胱甘肽的亲和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白进行纯化，最后通过含有游离的谷胱甘肽的缓冲液,洗脱结合的GST融合蛋白。 • Poly His多聚组氨酸能与多种过渡金属或过渡金属鳌和物结合，因此带HIS-6的蛋白能结合与固化的Ni2+树脂，用适当的缓冲液（PBS）洗冲洗去除其他杂蛋白后，再用可溶的竞争性鳌合剂（咪唑）洗脱可以回收靶蛋白。

23. 实验原理 • 目的蛋白质的检测 • 蛋白质分子量的检测 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 目的蛋白质的分析

24. 实验原理 • 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。 • SDS是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，强还原剂例如β巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，通过加热使蛋白质解离。解离后的氨基酸侧链与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。

25. 蛋白质中加入 SDS 并加热， SDS 分子上的非极性区 (黄色尾巴)会与蛋白质上的非极性区结合，使蛋白质变性，成为一线状长条分子，上面布满 SDS 分子。SDS 分子的极性区 (洋红色圆点)，则露在外面，以增加亲水性。 SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白质分子间的天然的电荷差异。SDS最终使蛋白质变成具有高负电荷的线状分子。

26. 97.0 kDa

27. 实验准备

28. 仪器与设备 • 诱导、培养 • 37℃恒温摇床 • 电泳检测 • Hoefer miniVE Vertical Electrophoresis System

29. 实验试剂 • LB培养基、Amp、IPTG • 30%丙烯酰胺贮液 • 1.0M Tris(PH6.8)(浓缩胶),1.5M Tris(PH8.8)(分离胶) • 10%SDS，10%过硫酸铵（AP），四甲基乙二铵（TEMED） • 1XTris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM Tris, 250mM 甘氨酸，0.1% SDS • 1xSDS上样缓冲液：50mM Tris-HCl（6.8），100mM DTT，2% SDS，10% 甘油，0.1% 溴酚蓝 • 染色液：90甲醇：90冰乙酸：20水＋0.5g R-250 • 脱色液：90甲醇：90冰乙酸：20水

30. 实验步骤

31. 实验步骤 • 培养 • 诱导 • 样品制备 • SDS-PAGE • 凝胶检测

32. 目的蛋白质的诱导表达及检测 1）挑取单菌落，接入3ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养液， 37℃培养过夜。 2）取50ul过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（A600=0.5~0.6）。 3）吸出500ul未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，室温高速离心1min，沉淀悬浮于100ul 1 x SDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心1min，冰上放置。 4）在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，37 ℃继续培养3h，取500ul样品放于微量离心管中，室温高速离心1min。 5）沉淀悬浮于100ul 1 x SDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心1min，冰上放置，待全部样品处理完后上样。

33. SDS-PAGE 6 ）将电泳槽玻璃板洗净，吹干，并用凡士林封边,安装好 7 ）配12%分离胶，将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽 高三分之二处，加蒸馏水密封。待胶凝固后（约需 30min倒掉 水，用吸水纸吸干 8）配5%浓缩胶将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内（以插入梳子不 溢出为宜），插入梳子 9）待胶凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中 10）制备好的样品加入上样孔 11）连接电泳仪 12）打开电源，调整电压至80V，待样品跑过浓缩胶（大约需 30min）后将电压调至120V，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶 的底部距离下缘1cm时停止电泳，大约需2h，电泳结束。

34. 聚丙烯酰胺凝胶配制（mini VE）

37. 目的蛋白质的检测-考马斯亮蓝染色 • 考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue）是一种三苯甲烷纺织染料，又称酸蓝83，分子上含有两个S03H基团，偏酸性，能结合在蛋白质的碱性基团上。 • 能够检测出大于0.1ug蛋白条带。

38. 凝胶染色 • 将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色4小时（或过夜）。 • 脱染：将染液回收，凝胶先用蒸馏水漂洗一次，浸入脱染液中脱染，室温浸泡凝胶或37℃加热使其脱色，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带为止。 • 脱色后，将凝胶保存在水中或是20%甘油的水中。

39. 作业 • 按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤、实验结果。 • 阐述目的基因表达载体的构建。 • 分析实验结果。 • 包涵体的出现是目的基因的原核表达中常见问题，其发生原因是什么，如何解决？

40. 实验结果与分析

41. Thank you for your attention!