יצירת פרופיל שעתוק בעזרת טכניקת ה- SAGE עבור בקרת גדילה התלויה בגן p53 .

1. יצירת פרופיל שעתוק בעזרת טכניקת ה-SAGE עבור בקרת גדילה התלויה בגן p53.

2. מיהו הגן p53? • P53 הוא גן לחלבון חשוב בבקרת מעגל התא. • הגן מזהה מצב לא תקין של התא (לדוגמא, פגיעה ב-DNA) ועוצר את מעגל התא על מנת למנוע מהתא להיהפך לסרטני. לרוב תפקודו ייפגם לפני שהתא יכנס למסלול סרטני. • הגן מבקר את ביטויים של גנים המעורבים בעצירת מעגל התא (לדוגמא p21) ואפופטוזיס של התא (לדוגמא BAX)

3. הנושא הנחקר: • יצירת פרופיל שעתוק עבור בקרת גדילה המתווכת ע"י p53. כלומר, מציאת הבדלים בתבניות ביטוי הגנים בתאים בעלי 53P פונקציונלי ובכאלה ללא 53P פונקציונלי.

4. המערכת הניסויית • התאים הנחקרים: תאי פיברובלסטיים עובריים של חולדה (REF) שעברו טרנספורמציה עם RAS מאוקטב וגן p53 רגיש לטמפ' ממקור עכברי (REF val135) . • תאים אלו נחקרים בטמפ' המאפשרת יצירת חלבון p53 פונקציונלי, (˚c32) ובכזו שאינה מאפשרת (˚c38). • כתאי בקרה שימשו תאי REF שעברו טרנספרמציה עם HaRAS וp53 מוטנטי שאינו רגיש לטמפ' (REF Phe132)

5. תוצאות ניתוח התעתיקים :

6. איור זה מתאר את העלייה בייצוג של גנים כפונקציה של העלייה במספר הtags שנותחו. • האיור מדגים שתעתיקים חדשים רבים עדיין מזוהים גם לאחר ש-000 60 tags כבר נותחו.

7. תוצאות • בתאים REF val135 שהטמפ' שלהם הוסתה מ-˚c38 ל-˚c32 נצפתה עצירה בגדילה (בשלב 1G) ופנוטיפים של אפופטוזיס כבר לאחר כ-4 שעות. בנוסף, לאחר 8 שעות בתנאים אלו הגן p21 וכן ציקלין G עברו שעתוק יתר. • לעומת זאת, בתאי הבקרה שהוסטו לטמפ' של ˚c32 למשך 8 שעות , לא נצפתה עצירה בגדילה או אפופטוזיס, וכן בתאים אלו ובתאי REFval135 שהושארו ב-˚c38 כמעט ולא נמצאו תעתיקים של הגנים הנ"ל.

8. תאי הבקרה • בבדיקת תאי הבקרה REF-phe 132 זיהו מספר קטן של גנים שביטויים היה מוגבה לעומת רמתם בתאי REF-val135 .גנים אלו הם: galactin-1, MTS1, TRPM-2, osteopontin. • הדבר מציע פרופיל שעתוק אלטרנטיבי התלוי בחלבון p53 המוטנטי. • אולם עדיין יתכן שההבדלים נובעים מכך שהעדרו של p53 wt פונקציונלי גרמה להפחתת שעתוק סלקטיבית של גנים שגרמה לכך שגנים אלו יראו כבעלי ביטוי מועדף בתאי הבקרה.

9. ניתוח תוצאות SAGE • השוואה בין תוצאות ניתוח SAGE בין תאים REF val-135 ב-˚c38 וב-˚c32 הפיקה 28 גנים (p<0.01) ומתוכם 14 גנים (p<0.001) שמשועתקים יתר באפן משמעותי בתאים ששהו ב-˚c32. • לעומתם נמצאו 3 גנים שרמתם גבוהה יותר דווקא ב-˚c38, ואלו הםλ actin, α tubulin,HSP70. • בהשוואה בין ה REF val135 ב-˚c32 ל-REF phe 132 (המוטנטי) נחשפו 12 גנים (p<0.01) ומתוכם 3 גנים (p<0.001) המבוטאים בצורה שונה.

12. האם התוצאות מתאימות לידע הביולוגי? • השוואת רמות השעתוק עבור גנים המקודדים לחלבונים ריבוזומלים ולhouse keeping genes הראו רמות דומות בשתי הדגימות. כמו כן נצפתה רמה דומה עבור הגן לp53 האקסוגני (מה שמעיד של אופיו הניתן לחזרה של ניתוח ה SAGE). • גנים אשר ציפו שיעברו שעתוק יתר בנוכחות p53 פונקציונלי (MDM2, p21,cyclin G, BAX1) אכן הראו הבדל ברמת ביטויים בשתי ספריות ה SAGE. אולם נצפו מספר חריגות.

13. תוצאות מפתיעות 1. p21 יוצג בשכיחות נמוכה פי 5 או 6 ממה שציפו החוקרים, זאת בשל המצאותו של אתר רסטריקציה של אנזים הtagging בתוך התג לp21 שיוצר ע"י SAGE. 2. רצף פנימי של הcyclin G מופיע כtag בפני עצמו. נשאלת השאלה כיצד נוצר tag זה. סריקת ספריית cDNA עם התג לcyclin G כגלאי הראתה היברידיזציה שלו הן לRNA בגודל הצפוי והן תעתיק קטן יותר. לכן סביר שמדובר בשתי צורות אלטרנטיביות של RNA עבור cyclin G. כך גילה ה SAGE תעתיק חדש שלא היה ידוע קודם.

14. הפתעות • באופן מפתיע נמצאו רצפי tag למספר rRNA . הסבר אפשרי לכך הוא שתעתיקים אלו מכילים אזורים עשירים ב-A, ולכן, בזמן הכנת ספריית הSAGE מתקבלים הtags. • כל הגנים שזוהו קודם לכן מלבד U6snRNA ידוע היה ממחקרים קודמים שהם עוברים שעתוק יתר באופן התלוי בp53. הבחנה בגן זה לא אמורה להתאפשר ע"י SAGE. הסבר אפשרי: תוך כדי ביקוע הגרעין באפופטוזיס, snRNA זה משתחרר מהגרעין ועובר פולי-אדנילציה.

15. אישרור תוצאות אישור של שכיחות התעתיקים הושגה גם ע"י היברידיזציה עם ספרית cDNA עבור הגלאים EF1, cyclin G.

16. cDNA חלקיים חדשים שהושגו בעזרת ה SAGE • Clone 14 – הפיק ORF של 210 ח. אמינו שמראות הומולוגיה חזקה לאזור helix-loop-helix במשפחת פקטורי השעתוק HES (זוהה גם ע"י subtractive hybridization). • Clone 12 – הפיק ORF של 149 ח. אמינו שמראות הומולוגיה לחלבון ספציפי לרקמה, בעל פונקציונליות בלתי ידועה, שזוהה קודם לכן בבנ"א (קיימת כניסה ב GenBank). • Clone 9 - הפיק ORF של 164 ח. אמינו ללא הומולוגיה לחלבון מוכר. (קיימת כניסה בEST).

17. EGR-1 • EGR-1 הוא פקטור שעתוק. מבוקר ע"י טווח רחב של גירויי בקרת גדילה. • לאחרונה הוצע כי לEGR-1 יש תפקיד בהתמיינות תאית. לכן ניתן להניח שבתאי REF בעלי p53 פונקציונלי שעתוק היתר של EGR-1 נובע מ"טריגר" של מכניזם מולקולרי הדומה להתמיינות. בנוסף, רמתו הגבוהה של EGR-1 בתאים אלו אשר חלקם עוברים אפופטוסיס יכולה להצביע על תפקיד חשוב יותר לפקטור זה במנגנון המוות התאי.

18. Differential display מול SAGE • בעבר בוצע ניתוח של differential display עבור מערכת הבקרה של p53 בREF. בניתוח זה בודדו הגנים 11CGR ו CGR19. • ע"י ניתוח SAGE ניתן לראות כי גנים (לא ידועים) רבים נוספים גם הם משועתקים יתר ברמה דומה ע"י p53. (לא ניתן היה לזהותם ע"י הdifferential display). • בנוסף, differential display הצביעה על גנים נוספים אחרים שמבוקרים ע"י p53, אך ממצאים אלו לא אושרו ע"י שיטות ניתוח נוספות כגון northern analysis.

19. מציאת גני מטרה של N-myc המתפקדים ביצירת הריבוזום ובסינטזת חלבונים.

20. מיהו myc? • פרוטואונקוגן שגורם לסרטן. מקודד לחלבון השוכן בגרעין. • האונקוגנים myc ידועים בריבוי ההשפעות הפנוטיפיות שלהם. ידוע שהם בעלי תפקיד בגדילת התא, התחלקות התא, שליחת גרורות, חסימת התמיינות, ואפופטוזיס. • N-myc האונקוגן שמופיע בנוירובלסטומה, L-myc אונקוגן שמופיע בסרטן ריאות.

21. נושא המחקר • עדיין הידע שלנו על גני המטרה של myc הוא חלקי . ע"מ להגיע להבנה מעמיקה יותר נעזרנו בטכנולוגית הSAGE. • תיאור השימוש בSAGE לשם זיהוי הגנים שמאוקטבים באופן ישיר או עקיף ע"י N-myc בנוירובלסטומה בבני האדם. • מחקר זה יראה שגני myc מתפקדים כמבקרים עיקריים של מנגנון סינטזת חלבונים.

22. המערכת הניסויית • SHEP הם תאי נוירובלסטומה שאין בהם ביטוי של c-myc. • התאים הנחקרים –לתוך cell line של SHEP הוחדר וקטור המכיל N-myc שביטויו תלוי בטטרא-ציקלין (Tc). התוצר המתקבל הוא SHEP-21N. • כבקרה, השתמשנו ב SHEP-2 clone שעבר טרנספקציה עם וקטור ריק מגנים מבוטאים.

23. ניתוח ביטויים של יותר מ 000 40 תעתיקים זיהה 114 גנים שהינם משועתקים יתר, בתאים המבטאים N-myc. בנוסף לכך נמצאו עוד 70 tags ששעתוקם הופחת בתאים שבהם N-myc מבוטא. אולם אנו נתמקד בניתוח הtags שעברו שעתוק יתר. ספריות ה SAGE של נוירובלסטומה

24. חלבונים ריבוזומלים • הקבוצה הפונקציונלית הראשונה מורכבת מ-56 גנים לחלבונים ריבוזומלים. שרמת הגברתם היתה עד פי 37. מובהקות סטטיסטית של עד 0.01. • 10 tags נוספים היו בעלי מובהקות סטטיסטית נמוכה יותר – עד p<0.05 • 66 tags אלו מתאימים ל-82% מהחלבונים הריבוזומלים הקיימים בבני אדם.

27. אישרור תוצאות ה SAGE

28. חלבוני גרעין • קבוצה פונקציונלית שניה של גנים בעלי בקרת יתר ב SHEP21N. היא מכילה 2 גנים לחלבוני גרעין: • Nucleophosmin – חלבון אשר מעבד rRNA ע"י ביקוע הקצה ה-'5 של ה S pre-rRNA 5.8 ומתפקד בכינוס ושיוט בין הגרעין לציטופלסמה של החלקים הפרה-ריבוזומלים. • Nucleolin – חלבון בעל שני tags הודות לתעתיק אלטרנטיבי. החלבון מעבד pre-rRNA ל18S rRNA בוגר. החלבון נקשר ל nucleophosmin וכן מעורב בכינוס החלקים הפרה-ריבוזומלים ושיוטם בין הגרעין לציטופלסמה.

30. ניתוח תוצאות • שיעתוק היתר של שני הגנים האלו מרמז שיצירת הריבוזום והבשלת rRNA הן מטרות של הN-myc. • בנוסף נמצאו tags התואמים ל-9 פקטורי אינציאציה ואלונגציה שעברו שיעתוק יתר.(מסומנים בתכלת) • מידע זה תומך בתפקידו של N-myc בבקרת סינטזת חלבונים.

31. גנים נוספים שנמצאו בבקרת יתר • αNAC מגן על חלבונים המתהווים בציטוזול מפני טרנסלוקציה ל endoplasmatic reticulum. (מסומן בסגול) • שני צ'פרונים מרמזים על עליה ביכולת התא להביא חלבונים לקיפול והבשלה. (מסומן בסגול) • בנוסף, יתכן ויכולת התא לפירוק חלבונים עלתה. 3 גנים לחלבונים ממסלול הubiquitin ו-3 תת יחידות של proteasome. (מסומן בבורדו)  • קבוצה פונקציונלית נוספת של גנים העוברים שעתוק יתר ע"י Nmyc מקודדים לאנזימי מפתח במסלול הגליקוליזה.

32. שאלת הביצה והתרנגולת • במספר מערכות נצפה שc-myc מזרז את גדילת התא ועליה במסת התא. • בנוסף הראנו שמספר גנים בעלי תפקיד בסינטזת חלבונים עוברים שעתוק יתר בתאי SHEP21N. • כעת נשאלת השאלה: האם שעתוק היתר של גנים אלו גורם לגדילת התא, או שעליה זו גורמת להגברת ביטוי הגנים? • בצענו time course experiment כדי לבדוק אם הגנים המדוברים הם מטרות מוקדמות או מאוחרות בבקרה של Nmyc.

33. ביטויו של Nmyc יכול להיות מופסק באופן הפיך בתאי SHEP21N ע"י טיפול בTc . 24 שעות לאחר תחילת הטיפול שטפנו את התאים וגידלנו אותם למשך 36 שעות נוספות ללא Tc ניתוח western blot מראה שביטוי החלבון Nmyc מופיע בסמיכות לביטוי הmRNA שלו. switch off by tetracyclin