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Chapter 5 核 酸

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  1. Chapter 5 核 酸 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)含有构筑细胞所需的信息。该信息被安排在许多称作基因(Gene)的单位中, 基因控制着生物可辩认的特征。贮存在DNA中的信息通过转录的方式使信息转移到核糖核酸(ribonucleic acid ,RNA)上，这类RNA称作信使RNA (mRNA)；mRNA含有来自DNA的、指令蛋白质全部氨基酸顺序的信息。DNA上的信息并不都用于编码蛋白质，有相当一部分信息转抄给转移RNA(transfer RNA ,tRNA)和核糖体RNA( ribosomal RNA, rRNA)。前者在蛋白质合成中起转运氨基酸的作用, 后者是核糖体的主要组分。核糖体是蛋白质合成的主要场所。

  2. Section 1. DNA & RNA 是核苷酸构成的线性多聚物 一、 DNA & RNA的化学组成 生物大分子的一个显著特点是: 由小分子的单体聚合而成。构成DNA & RNA的小分子单体分别是四种不同的核苷酸。核苷酸由三部分组成，即碱基、戊糖 & 磷酸基。在RNA中的戊糖是核糖，在DNA中的戊糖是脱氧核糖。 有两种类型的碱基, 即嘌呤碱和嘧啶碱. 嘌呤碱有腺嘌呤和鸟嘌呤; 嘧啶碱有胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶（图5-1）. 这些碱基按照上面的顺序分别以A、G、C、U、T代表. 戊糖与碱基结合所形成的物质叫做核苷(nucleoside),核苷再与磷酸结合即成为核苷酸. 构成DNA和RNA的核苷酸, 除了戊糖的差别之外,另一个显著的差别是,DNA中的核苷酸不含尿嘧啶,RNA中的核苷酸不含胸嘧啶.在构成核酸的核苷酸中，磷酸基都结合在戊糖的C5'上，故称5'-核苷酸。 DNA是由脱氧腺嘌呤核苷酸(5‘-dAMP)、脱氧鸟嘌呤核苷酸(5’-dGMP)、脱氧胞嘧啶核苷酸(5‘-dCMP)和脱氧胸腺嘧啶核苷酸(5’-dTMP)组成.A RNA则由腺嘌呤核苷酸(5'-AMP)、鸟嘌呤核苷酸胞(5'-GMP)、胞嘧啶核苷酸(5'-CMP)和尿嘧啶核苷酸(5'-UMP)组成（图5-2）。

  3. 二、 核苷酸的紫外吸收性质 由于碱基含有共轭双键结构，故核苷酸在紫外光区具有强烈的吸收特性，其最大吸收是260nm处左右。利用紫外吸收差别，可鉴定各种核苷酸和对核苷酸进行定量分析。 三．核苷酸的解离性质及其分离 核苷酸分子中的各种碱基杂环中N杂原子及一些取代基具有结合和释放质子的能力，故它们既具有碱性解离又具有酸性解离的性质。除了碱基的解离外，核苷酸分子中的磷酸基也是可以解离的： 核苷酸 碱基的解离 第一磷酸基 第二磷酸基 AMP 3.70 0.9 6.01 GMP 2.30 0.7 5.92 CMP 4.24 0.8 5.97 UMP - 1.0 5.88

  4. 图5-3是四种核苷酸在不同pH下的解离曲线。从图种可以看出，第一磷酸基和碱基氮杂原子的解离曲线的交点的pH值是二者解离度刚好相等的pH值，即等电点。认识和了解核苷酸的解离, 对分离核苷酸具有重要的意义。在pH3.5时，各碱基的质子化程度的顺序是:CMP(+0.84) >AMP(+0.54) > GMP(+0.05) >UMP(0)；核苷酸第一磷酸基在pH3.5时都己完全解离，各带上一个单位的负电荷。此时，整个核苷酸分子分子的带电状况是: AMP = -1 + 0.54 = -0.46， GMP = -1 +0.05 = -0.95 CMP = -1 + 0.84 = -0.16， UMP = -1 + 0 = -1 它们都带上负电荷，其顺序是: UMP(-1) ＞ GMP(-0.95) ＞ AMP (-0.46 ) ＞ CMP(-0.16) 故可在pH3.5的电泳缓冲溶液中进行电泳分离。 离子交换树脂的非极性吸附对于嘌呤碱和嘧啶碱来说，二者的差别很大，对于嘌呤环的非极性吸附比对嘧啶环的非极性吸附大得多，消除它们之间的电荷差别；所以实际上洗脱的顺序是: UMP → GMP → CMP → AMP

  5. 四、 DNA和RNA的共价结构 1. 磷酸二酯键与多核苷酸链 DNA和RNA是由核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的线性大分子(图5-4)。 ◆电位滴定法(图5-5) ◆酶水解法: 蛇毒磷酸二酯酶；牛脾磷酸二酯酶 2. 核酸共价结构的表示法 亦可用(5') pApCpGpApUpU表示，或5'pACGAUU3' 表示。

  6. Section 2. DNA的结构 一、 DNA分子的碱基组成规则 ■嘌呤碱基(A+G) 等于嘧啶碱基(C+T) ■腺嘌呤与胸腺嘧啶等量存在，鸟嘌呤与胞嘧啶等量存在,即A/T = G/C =1.这点对于DNA双螺旋结构模型的提出具有特别重要的意义。 根据DNA分子的碱基组成，只要知道这四种碱基中的任何一种含量，即可计算出该DNA分子碱基之间的比例关系。这种关系常用 “G·C”值，即G + C的百分含量表示。例如， G·C 值为40%，即可知G =20%，C =20%，A =30%，T =30%. DNA的碱基组成无组织或器官的特异性，但有种属的特异性；也不因年龄、营养状况而变化。

  7. 二、 DNA的二级结构 1．Watson-Crick双螺旋结构(double helix)(1953年) ●两条多核苷酸链是反向平行的,即两条多核苷酸链5‘→3’走向是相反的（图5-6a）。●两条多核苷酸链的糖-磷酸骨架位于双螺旋的外侧, 每条链上的相邻的碱基彼此以平行的平面堆积（图5-6b）。●两条反向平行的链对于碱基合适的空间组合是很重要的. 在天然DNA分子中, 二条链间按照A与T; G与C的碱基配对规则互补配对.●相邻的碱基对之间的轴距为0.34nm；每个螺旋的轴距为3.4nm。 Watson-Crick于1953年在Nature发表了这篇里程碑式的论文(图5-6C) 但实际测出的双螺旋DNA的每个螺旋的轴距为3.5nm, 故双螺旋DNA的每轮螺旋包含10.5个bp. 2. 维持DNA双螺旋稳定的作用力 ▲两条核苷酸链碱基对之间的氢键（图5-7）； ▲碱基对之间的堆积力（包括疏水作用和范德华力）。G·C对间的堆积力大于A·T对.这是含G·C高的DNA比A·T含量高的DNA在热力学上更稳定的主要因素.堆砌中的不同套的碱基对有不同的堆积能(表5－1).因此,双螺旋的堆积能是顺序依赖的. ▲多核苷酸链上带负电荷磷酸基与介质中的阳离子或阳离子化合物的结合，抵消了带负电荷的磷酸基团之间的排斥作用, 有利于螺旋的形成与稳定。

  8. 3．DNA二级螺旋的其他形式 上述DNA双螺旋结构特征是针对在相对湿度为92%时制备的DNA钠盐纤维即所谓B-DNA所具有的构象. 但在相对湿度为75%时制备的DNA钠盐纤维称之为A-DNA。 Z-DNA结构的发现：1977年Rich等人用人工合成的dCGCGCG六核苷酸进行X-射线晶体衍射分析，观察到一种特殊的左手双螺旋结构。该DNA的骨架走向呈锯齿状(Zig-zag)，故称Z-DNA（图5-8）。 4. DNA结构的多样性：单股DNA，单股环状DNA，三股DNA。 三. DNA的超螺旋结构 1. DNA结构的柔性 DNA双螺旋结构具有一定的柔性(flexibility), 即 DNA螺旋可以从轻微的弧形到明显的弯曲之间改变它们的形状(图5-9)。这对于DNA分子在细胞内的包装是重要的。

  9. 2．DNA结构的柔性是受到限制的 一个核苷酸单位的构象可以用糖-磷酸骨架上的6个扭角以及安排碱基位置的扭角来描述(图5－10)。每个核苷酸的7个自主的角度应该使得一条多核苷酸链具有高度的柔性。然而,这些扭角受到限制它们自由旋转的内部张力的约束。一个碱基绕它的糖苷键的旋转也受到极大的限制。戊糖环本身的柔性也是受到限制的.糖隆起在核酸的构象中是重要的,因为它决定磷酸基相对于糖残基的位置。 3．DNA的超螺旋 由于DNA的结构具有柔性，故DNA双螺旋可以形成超螺旋。超螺旋是指螺旋轴本身的扭曲。DNA超螺旋是DNA结构张力(structure stain)的一种表现形式；相反，如果DNA双螺旋的没有弯曲，则它处于一种松弛的状态(relaxed form)(图5-11)。 超螺旋的形成不是一种随机的过程，只有当DNA处于某种结构张力时才出现。在闭合环状的双螺旋中,DNA旋转不足(underwinding) 是张力产生的原因.

  10. DNA双螺旋因欠旋所产生的张力状态代表了一种能量贮存形式。当超螺旋形成时，这种张力随之释放。处在超螺旋状态的DNA使每轮螺旋的bp数接近B-DNA所具有的数目。DNA双螺旋因欠旋所产生的张力状态代表了一种能量贮存形式。当超螺旋形成时，这种张力随之释放。处在超螺旋状态的DNA使每轮螺旋的bp数接近B-DNA所具有的数目。 由于DNA螺旋的双链右手旋转是正向的，故因补偿螺旋旋转不足(欠旋) 所造成的影响而形成的超螺旋则是负的，负的超螺旋和欠旋之间的相互转换在蛋白质同DNA结合时可能起到促进作用。据认为，所有天然DNA的超螺旋都是负的超螺旋(negative supercoil)。 如果DNA双螺旋因旋转过度(overwinding)，就会造成每轮螺旋超过10.5 bp. 于是以相反的方向形成正的超螺旋。正的超螺旋会出现在DNA复制叉的头部和转录时RNA聚合酶的前面，必须通过拓扑异构酶将该超螺解除。拓扑异构酶能打断DNA, 消除张力, 并重新接上断开的链。

  11. 4.DNA的拓扑学性质 拓扑学是数学上的一个分支, 可用来表述两个相互绕在一起的环在几何学形态上的相互关系。在描述DNA分子的拓扑学性质时, 涉及到三个参数： ★连环数(linking number,L): 是指共价闭合的DNA分子的两条链相互缠绕的次数。只要DNA双螺旋保持完整，其值不会变。对于闭合环状DNA，其值也是整数。 ★缠绕数(twist,T): 指螺旋的轮(圈)数。 ★超螺旋数(writhing number,W)：指DNA双螺旋绕超螺旋轴的次数。DNA拓扑学上的关系可用下面的式子表示: L = T + W T和W可以不是整数。 一给定环状DNA分子因拓扑学性质的不同而产生的不同形式,例如，松弛形和超螺旋，称为拓扑异构体(topoisomers)（图5-11）。 ●为了描述DNA分子的超螺旋性，于是就引出了超螺旋密度（σ）（Superhelix density）或比链环差(Specific linking different) σ = (L – L0)／L0

  12. 天然状态的SV40DNA的超螺旋密度σ= 475-500/500 = -0.05，多数处于天然状态的共价闭合的环状DNA的超螺旋密度为-0.05左右。超螺旋密度与DNA分子长度无关，但该值的正负性则与螺旋旋转过度(正值)和旋转不足(负值)有关。 四、DNA结构与功能的关系 1.DNA是遗传物质———细菌转化实验 2.基因是DNA分子上的一段顺序 编码多肽链和RNA的基因称为结构基因。DNA分子上也含有其他顺序，只有纯粹的调节功能。调节顺序或调节基因提供的信号可指示结构基因的开端和结尾，或者参与结构基因转录的启动和关闭，或者在复制或重组中发挥起点作用。所以，基因是DNA上的一段编码某种多肽链或RNA的顺序，扩大来说,也许还包括不被转录和不被翻译的具有调节功能的顺序 。 3．DNA双螺旋结构提供了遗传信息传递的基础： DNA双螺旋的性质为其半保留复制提供了结构基础（图5-12）。

  13. 4.基因指导蛋白质合成 在遗传信息的表达中，编码蛋白质的基因，将信息转录给蛋白质合成的直接模板mRNA，mRNA线性顺序上的每三个核苷酸编码一个氨基酸，每三个核苷酸称为一个氨基酸的遗传密码.故mRNA上的线性的核苷酸顺序就决定了蛋白质的氨基酸线性顺序。即基因的遗传信息通过mRNA的传递，最终以蛋白质的形式表达出来。 5’...A A G A A A G T T A T T T T C T T T G A G . . .3’ 3’...T T C T T T C A A T A A A A G A A A C T C ... 5’ 被转录的链 ↓转录 5’...A A GA A AG U UA U UU U C U U UG A G... 3’ ↓翻译 N端…Lys—Lys—Val—Ile— Phe —Phe —Glu...C端

  14. 五.DNA顺序的测定 1.DNA限制牲内切酶(restriction endonucleases) DNA限制牲内切酶的一个显著生物学作用是使侵入细菌细胞的外源DNA降解,却不能降解自身的DNA.因为细菌具有一种限制与修饰系统。限制是为了降解入侵的外源DNA,修饰是为了保护内源DNA不被自身的限制牲内切酶降解。在细菌中，限制与修饰是对立统一的。DNA的修饰具有严格的专一性，是由专一性的修饰酶（主要是甲基化酶）来完成的。甲基化酶的识别与修饰部位常与限制牲内切酶的识别与作用部位相同. 有二种类型的限制牲内切酶，类型Ⅰ是一类复杂的多功能酶,既能降解又能修饰DNA。这类酶由多个亚基组成。类型Ⅱ是一类较为简单的酶，其活性需要Mg2＋，既不表现出甲基化酶的活性，也不不表现出ATP酶的活性，但能识别DNA分子上特定顺序，如该顺序未被修饰,就能在该顺序的部位上降解DNA.这类限制牲内切酶识别部位一般是4 – 6个bp对的特定顺序，并呈现为双重旋转对称(即迥文结构). 有些酶，例如，EcoRⅠ作用于DNA时,在它的识别部位上可产生粘性末端(cohesive termini);有些酶，例如，EcoRV和HpaⅠ作用于DNA时,在其识别部位上产生平齐末端(even termini)（图5-13）。

  15. 2.DNA的物理图谱(酶切图谱) 一个DNA分子用限制性内切酶降解后得到许多大小不同的片段，确定这些片段在DNA大分子中原来的位置得到的图谱称之为酶切图谱或物理图谱(physical map)。 目前常用的酶切图谱法有多种,主要有部分酶切法,交叉酶切法,末端标记部分酶切法等,而部分酶切法是其他方法的基础。 图5-14示出了一假想的DNA用交叉酶切所获得的物理图谱。 3.DNA片段的核苷酸顺序测定 有二种极为有效的方法：链终止法(chain-termination method)和化学裂解法. 链终止法是利用5‘-脱氧核苷三磷酸（5’-dNTP）的类似物2‘,3’-双脱氧核苷三磷酸（2‘,3’-ddNTP）取代正常的底物。在DNA合成过程中，当2',3'-ddNTP 参入到延长链中时，DNA的合成便终止。由于链终止的部位是随机的，所以可以获得任何一种长度的DNA片段，然后通过凝胶电泳分离，并进行放射性自显影，即可从自显影的胶片上读出DNA片段的核苷酸顺序。

  16. 分四组,每组加入四种5‘-dNTP(其中一种含放射线标记)和一种2',3'-ddNTP,并加入E.coli DNA聚合酶Ⅰ,满足DNA合成所需条件,进行该片段互补链的合成。当加入的2',3'-ddNTP参入到链中后,因该类似物脱氧核糖的C-3’位上无OH,不能与下一个核苷酸连接,故链的延长被终止。例如，加入5'-dGTP类似物ddGTP,则链的延伸会在鸟苷酸残基处终止（图5-15）。 4.DNA组织结构上的某些特点（略）

  17. Section 3 RNA 的 结 构 与 功 能 一、RNA的类型和一般结构特征 除某些双股病毒RNA外,其他都是单股分子,但RNA分子可通过自身的回折,在分子内部形成局部的双螺旋区. RNA局部的双螺旋结构与DNA的A-型结构相似，每轮螺旋约有11个bp. 二、mRNA的结构特征 mRNA存在于细胞质中,是基因的细胞质信使,直接指导蛋白质的合成。 1. Shine-Dalgarno顺序 在原核生物mRNA起始密码子AUG上游约10核苷酸处,有一段富含嘌呤核苷酸顺序,该顺序称为前导顺序(Leading sequence)(图5-16).因Shine Dalgarno首先发现,故又称为Shine-Dalgarno顺序，简称SD顺序。该顺序与翻译起始有关，是核糖体小亚基16SrRNA结合的部位。

  18. 2、 5'-端甲基化的“帽”结构 在真核生物中mRNA的5'-端有一个甲基化的鸟苷酸残基.这是mRNA前体在转录合成后加上去的。这种“帽”结构是大多数真核生物mRNA结构上的一个重要特征。由于真核生物中mRNA缺少SD顺序，故该特殊的帽结构可能为真核生物mRNA翻译起始提供一个可识别的标记,亦可阻止5'-核酸外切酶的降解(图5-17). 3、 3'-端多聚腺苷酸结构 在真核生物中,成熟的mRNA 3'-端有一段长约50—100个或更长的腺苷酸(poly A)尾链结构(图5-17)。然而它的前体的 3'-端只有一段保守的AAUAAA结构，成熟的mRNA3'-端的poly A结构位于这段保守序列下游约10-30个核苷酸处。显然，这段序列为腺苷酸的酶促转移、加到它的3'-端提供了加入点（或信号）。3'-端poly A结构可以提高真核生物mRNA的稳定性。 三、转移RNA的结构 tRNA是一种能结合特定氨基酸，并能识别mRNA上该氨基酸的密码子,将该氨基酸转运到正在合成的蛋白质多肽链中去的接合体分子。

  19. 1. tRNA的二级结构 tRNA是典型的单链分子，其长度约在75个核苷酸左右。根据碱基互补的原则，tRNA的多核苷酸链通过自身的回折，可以形成类似三叶草的二级结构。绝大多数tRNA都具有这种三叶草型的结构（图5-18）。tRNA的二级结构的两个主要特征是： ◆5'端和3'端碱基互补配对形成7个bp的臂。因该臂的3'端具有共同的、能与氨基酸结合的－pCCA－OH结构，故该臂称作氨基酸接受臂（acceptor stem）或称氨基酸臂。 ◆在与氨基酸臂相对的另一端，有一个由7个碱基组成的突环。该突环因顶端含有能识别mRNA密码子的反密码子，故把这个突环称为反密码环。反密码环通过反密码臂与tRNA的其他部分连接。 ●分析不同来源的tRNA结构后发现，约有15个碱基的位置总是不变的，大约有8个碱基的位置是半不变的。这些不变或半不变的碱基大多数出现在突环中。 2.tRNA的三级结构 tRNA可以在二级结构的基础上进一步折叠形成倒L－行的三级结构（图5-19）。

  20. tRNA复杂的三级结构是由于广泛堆积作用和螺旋臂间的碱基配对来维持的。氨基酸的接受部位和反密码子部位分别位于倒L-型的两端。tRNA狭长部分的宽度约为0.2-0.5nm,这是它们生物学功能所必需的。因为当蛋白质合成时，两分子的tRNA必需同是结合在mRNA的两个密码子上。 tRNA的复杂的三级结构是由广泛堆积作用和螺旋臂间的碱基配对来维持的。在这些相互作用中所涉及的大多数碱基都属于不变和半不变的，这为所有tRNA都有相似构象提供了基础。 四．核糖体RNA的结构与功能 核糖体是蛋白质合成的机构，由大小两个的亚基组成。在原核生物中，这两个亚基分别是30S（小亚基）和50S（大亚基）。在真核生物中，这两个亚基分别是40S（小亚基）和60S（大亚基），S表示它们在超离心时的沉降系数。核糖体大约由65%的RNA和35%的蛋白质组成。 rRNA的结构以及核糖体的组成见图5-20a,图5-20b。 rRNA与功能的关系是与它们同核糖体蛋白包装或核糖体密切相关的，与mRNA和tRNA在核糖体上结合以及mRNA的信息翻译成新生肽链密切相关（图5-21）。

  21. Section 4. 核 酸 的 性 质 一、核酸的粘性(Viscosity) 天然DNA溶液具有很高的粘性,但当DNA变性时其粘性急剧下降.根据大分字的粘度特征，高分子溶液比普通溶液的粘度大，不规则线团比球状分子的粘度大，而线性分子的粘度比无规线团的大。当DNA在溶液中处于天然状态时，由于双螺旋的刚性以及长长的线性结构，天然DNA的粘度很大，即使稀溶液其粘度也很大。DNA变性后，由于双螺旋的刚性失去，氢键断开，两条链彼此分开，单链分子处于随机卷曲状态，因而粘度急剧下降。因此，DNA粘度的改变，可作为DNA分子变性的重要指标。 二、核酸的紫外吸收特征 核酸含有嘧啶碱和嘌呤碱基，因而DNA 和RNA在紫外光区具有吸收特性，其最大吸收在260nm处。 利用核酸和蛋白质紫外吸收差别，可鉴定核酸制品中蛋白质杂质。例如，纯净的DNA A260:A280的比值大约介于1.65～1.85. 若比值过高，则表明污染有RNA, 比值过低则表明有蛋白质或酚污染。

  22. 在核酸变性实验中，常引用摩尔磷消光系数。摩尔磷消光系数是指含磷为1.0摩尔浓度的核酸水溶液在260nm处的消光值,用ε(p) 表示： ε(p) = A260／C·L = A260×30.98／ W·L A: 被测核酸样品的消光值；C: 每升溶液中磷酸摩尔数； W: 每升溶液中磷的重量；30.98是磷的原子质量； L: 比色杯的内径。 核酸变性时，ε(p)值就会大大升高，当复性时，ε(p) 便降低或恢复到原来的水平，故ε(p) 可作为核酸变性与复性的重要指标。 三、核酸的沉降特性和密度特征 1.沉降特性：核酸沉降的速度与它的分子大小及形状和结构有关。核酸的沉降系数(S) 与分子量之间呈现对应关系。由于分子的构象对它的沉降特性有很大的影响，故这种对应关系只是相对一定的构象而言，若分子量相同，其构象不同，则S就不同（图5-22）。同一种DNA，变性后的S要比天然的大。

  23. 2. DNA的(浮力)密度(buoyant density) 把DNA放在密度梯度介质的上面，以相当高的速度离心时，DNA在梯度中迁移，直到达到同它自己的密度相同的部位为止，即漂浮于介质的某一密度梯度中，该部位称作DNA的(浮力)密度。不同的DNA具有不同的(浮力)密度。可利用(浮力)密度的差别，借助密度梯度超离心法来分离制备DNA。 DNA的(浮力)密度与其分子的碱基组成有密切的关系，与G·C含量在一定范围内(20%--80%)呈正比关系。Schidkraut et al. 导出了下面公式： ρ = 1.660 + 0.098 ( G + C,) DNA的(浮力)密度与其分子构象有密切的关系，与分子大小无关。 DNA变性后，分子卷曲成致密的线团，故比天然DNA的(浮力)密度大。 四、DNA的变性与复性 1. DNA的变性 在水溶液中，双股DNA分子在某些物理因素或化学因素的影响下，双螺旋结构中的碱基堆积力和碱基对间的氢键受到破坏，严密的双股螺旋变成了两条单一的随机卷曲的多核苷酸链，该现象称作DNA变性。

  24. 热变性是DNA的一个极其重要的性质，在研究DNA时常用到这一性质。若将DNA稀溶液加热到80℃左右几分钟，双螺旋结构就会受到破坏，氢键断开，形成无规线团（图5-23）。这种变化叫做螺旋→线团转换（helix-coil transition）. ▲任何多聚核苷酸在260nm处都有一个特征性的紫外吸收的最大值，但这种吸收在天然DNA分子中，由于碱基的堆积而受到抑制，比组成双螺旋分子的两条单链处在随机卷曲状态的吸收或核苷酸单体的总吸收要低得多，这种现象称作低色效应或减色效应(hypo- chromic effect)。当DNA溶液慢慢加热到双螺旋开始解链前，在260nm处的吸收基本保持不变。但当温度达到一定高度(一般在750C以上)时，紫外吸收急剧增加直到两条单链完全分开成随机卷曲状态为止。紫外吸收随变性程度加剧而升高的现象称为高色效应或增色效应(hyper-chromoc effect)。一般来说，DNA分子变性后，紫外吸收增高30—40%.在热变性过程中，双股螺旋被解开一半的温度称为解链温度或融解温度(melting temperature) 或转换温度(transition temperature)，用Tm表示。 不同DNA分子的Tm差别与其碱基组成有密切关系。在标准条件下，即在0.15mol/L NaCl – 0.0l5mol/L的柠檬酸钠(1×ssc)溶液中，Tm与DNA碱基组成间的关系： Tm = 69.3 + 0.41(G + C) Tm受离子强度、pH等影响。

  25. 2.DNA的复性 DNA在变性后，慢慢冷却，两条单链则可重新结合,回复到双螺旋结构，这一过程称为复性(renaturation)。复性的温度不能太低，一般比解链温度低250C左右为宜。影响DNA复性速度的因素有：★DNA的大小；★离子强度；★DNA浓度。 复性的速度服从二级反应动力学，即重组合的速度与两条单链的浓度成正比： －dC/dt＝kC2 (1) 这里,C是t时间的单链DNA的浓度,以每升(L)中核苷酸的摩尔(mol)数表示；t是以秒(s)表示的时间, k是二级反应的速度常数, k值取决于阳离子浓度﹑温度﹑片段大小以及DNA序列的复杂性.(1)式可改写成: －dC/C2＝k·dt 在反应初始时,t＝0, C＝Co, 积分得到: （1/C）—（1/Co）＝kt C/Co＝1/(1＋kCo·t) (2)

  26. 在反应初始时, 由于t＝0，所有的DNA都是单股,所以Co是总DNA的浓度, Co是已知的,C是可以测定的。在固定的条件下(DNA片段的大小﹑温度﹑pH及离子强度),以C/Co对Co·t作图,可得到如图5-24所示的曲线.当C/Co＝1/2时,则(2)式为: 1/2＝1/(1＋kCo·t1/2) Co·t1/2＝1/k (3) 因此, Co·t1/2定义为重结合(复性)反应进行到一半时的Co·t值.Co·t1/2是二级反应速度常数k的倒数。由于其他条件都可以固定,那么Co·t1/2可以作为DNA序列的复杂性的一种量度。Co·t1/2越大,DNA复杂性就越高。 DNA序列的复杂性(complexity)是指一剪断的DNA制剂以核苷酸对数计的最长序列的长度。例如,…ATATAT…是dAT的重复共聚物,它的复杂性是2;…AGTCAGTC…是dAGTC的重复共聚物,它的复杂性是4。对于那些不含重复序列的生物来说,其复杂性可以用来表示基因组的大小。细菌DNA的Co·t1/2比病毒的大,因而细菌DNA比病毒DNA更复杂,基因组也大得多。

  27. 由于Co·t1/2定义为重结合(复性)反应进行到一半时的Co·t值,因此可以用它来衡量复性的速度。Co·t1/2的乘积小,表明复性所需的时间少,复性的速度就快.例如,在起始浓度相同的情况下，大肠杆菌DNA的Co·t1/2约为9mol·L-1·s， 而T4噬菌体DNA的Co·t1/2约为0.3mol·L-1·s. 这表明，T4噬菌体DNA比大肠杆菌DNA复性速度快30倍。DNA分子信息含量愈大，复性所需要的时间就愈长。由于大肠杆菌DNA分子比T4噬菌体DNA分子大得多,即结构和信息含量比T4噬菌体DNA复杂的多,在溶液中核苷酸总浓度相同的条件下,大肠杆菌DNA互补单链数就比T4噬菌体DNA少得多,扩散的阻力也大得多,因而复性的速度就慢得多。哺乳动物基因组Co·t1/2约为104mol·L-1·s。若实验所用的DNA的浓度为10-4mol·L-1，则需要108秒才能达到104mol·L-1·s，即需要约三年的时间才有一半重新结合。在复性实验中还发现，约有10％的小鼠DNA的复性速度比病毒DNA的还要快。这表明小鼠DNA含有很多的重复顺序。因为在某一DNA内只有同时存在很多相同或很相似的顺序，才能很容易找到互补顺序。用DNA复性动力学的方法业已证明真核生物染色体DNA存在有高度重复顺序，中度重复顺序和单一顺序.

  28. 3.DNA印迹 变性DNA在一定条件下的重结合，也能在不同来源的两条DNA单链之间进行，甚至可以在DNA和RNA之间进行。但是,DNA-RNA杂交双链的稳定性低于相应的DNA双螺旋。因为重结合是以互补碱基顺序为基础的，只要在两条单链之间存在有互补顺序(虽不是整个顺序)就可以相互结合形成双链。所以，在DNA变性和复性的基础上建立了一种非常有用的技术---分子杂交(molecular hybridization)。利用分子杂交技术可以分离蛋白质的基因, 研究基因的转录和调节控制。近年来，分子杂交技术已经广泛地应用于DNA分子信息含量以及不同DNA分子的亲缘关系的测定。 E.Southern发展了一种很有用的方法可以用来鉴定具特定顺序的DNA。这个方法称作Southern blot(DNA印迹)(图5-24’)。DNA印迹法可以扩展用于特定RNA的鉴定。将RNA采用与DNA印迹类似的程序,可以用互补的、具放射性标记的RNA或DNA 探针与其杂交。为了与DNA印迹法相区别,一语双关地把这种检测RNA的方法叫做Northern Blot(RNA印迹)。特定的蛋白质也可采用类似的程序进行鉴定.所不同的是,所用探针是与该目标蛋白的抗体.这种方法叫做Western Blot或Immunoblot(蛋白质印迹或免疫印迹)。

  29. Section 5 核 酸 的 酶 水 解 能水解核酸的酶叫做核酸酶(nucleases)。所有的细胞都含有不同的核酸酶。核酸酶属于磷酸二酯酶(phosphodiesterases)，因为核酸酶催化的反应都是使磷酸二酯键水解。由于多核苷酸链内部每个磷酸基涉及与两端的两个糖残基的C-3′位和C-5′位的-OH形成磷酸二酯键,酯键可能是在磷酸基的3'-端或者5'-端被水解,因而产物的3'-端或5'-端含有磷酸基。为了简单图示核酸酶的水解部位,水解发生在磷酸基3'-端者用a表示,磷酸基留在相邻核苷酸的5'端；若水解发生在磷酸基的5'-端者用b表示,磷酸基则留在相邻核苷酸的3'端(图5–25)。有些核酸酶的作用部位是位于多核苷酸链的内部,这样的核酸酶称为核酸内切酶(endonucleases)；有些核酸酶是从核苷酸链的一端依次水解产生单核苷酸，这类酶称为核酸外切酶(exonucleases).

  30. 一.核酸酶的专一性 象大多数酶一样,核酸酶对它们所作用的底物具有不同的选择性。只作用DNA的酶称为DNA酶(DNases),只能催化RNA水解的酶称作RNA酶(RNases)。有些核酸酶的专一性差,它们既作用DNA,又能作用于RNA,这类酶称为非专一性核酸酶,例如核酸酶SI(nuclease SI)即是这样一种酶。有的核酸酶或许只对单股核酸(ssRNA或ssDNA,ss表示单股)表现出专一性,有的核酸酶可能只作用于双股核酸(dsRNA或dsDNA,ds表示双股)。有些核酸酶可能对多核苷酸链中的碱基具有不同的选择性,因而表示出不同的专一性。有的核酸酶只能识别特定的碱基顺序,并在该顺序内降解核酸,例如前面介绍的DNA限制性内切酶。 二.核糖核酸酶 胰核糖核酸酶A(RNase A)催化核糖核酸多核苷酸链内嘧啶核苷酸C-3′位磷酸基与相邻核苷酸C-5′位-OH之间的酯键(即图5－25所示的b部位),产生3'-端含磷酸基的寡核苷酸片段。该酶活性部位的两个His残基(His12或His119)以协同的方式进行广义的酸-碱催化。由于RNase A分子内含有4个二硫键,极大地稳定了它的结构,因而该酶是比较耐热的一种酶,即使在100℃下亦能表现出它的活性。

  31. 枯草杆菌含有一种与RNase A作用专一性相似的RNase,也是一种b–型内切酶。但是该酶切割的是嘌呤核苷酸C-3′位磷酸基与相邻核苷酸C-5'-OH之间的酯键,因而产物的3'-端含有嘌呤核苷酸。 从米曲酶(Aspergillus oryzae)中分离的核糖核酸酶T1(RNase T1)是专门水解RNA多核苷酸链鸟苷酸所在部位的酯键的一种b-型内切酶,产物是3'-端含有鸟苷酸的寡核苷酸片段。核糖核酸酶T2(RNase T2)是与RNase T1同一来源的一种内切酶,也是一种b-型酶.但它作用的产物是3'-端含有腺嘌呤核苷酸的片段. 上述这些核糖核酸酶可以用来测定较短的RNA片段的核苷酸顺序。例如一段RNA片段,分别用RNase A和RNase T1处理后,获得如下的信息: RNase A处理: C、U、G、AGAU RNase T1处理: AUG、CUAG 根据这两组碎片的碱基顺序的重叠情况,即可以确定该片段的核苷酸顺序是CUAGAUG,而不是AUGCUAG.

  32. 三. 脱氧核糖核酸酶 一般来说,脱氧核糖核酸酶(DNases)能催化单股的或者双股的多聚脱氧核苷酸链降解。从牛胰中分离的DNaseⅠ是一种a型内切酶，其产物的5'-端含有磷酸基,并对嘧啶和嘌呤核苷酸之间的磷酸酯键表现出某种程度的优先.在低浓度下,这个酶可以用来使dsDNA随机地在内部位置产生具有游离3'-OH的缺口(“nicks”)。具有缺口dsDNA是体外合成具有放射性标记的DNA分子的前体,可用于DNA的顺序测定,并在分子生物学研究中有不同的应用。 DNaseⅡ是一种b型内切酶,产物是3'–端含磷酸基的寡核苷酸片段.从动物的胸腺和脾脏中都可以分离到这种酶.

  33. 四.蛇毒磷酸二酯酶和脾磷酸二酯酶 蛇毒磷酸二酯酶(VPD或VPDase)和脾磷酸二酯酶(SPD或SPDase)是具有广泛应用的两种非专一性的核酸外切酶。VPD水解DNA或RNA是从具游离3'-OH端开始,作用于如图5–25所示的a部位,依次产生5'–核苷酸。因此VDP是常用来制备5'–单核苷酸的一种酶.SPD水解核酸链是从具游离的5'–OH端开始,作用于如图所示的b部位,依次产生了3'–核苷酸。SPD常用于制备3'-单核苷酸。 用蛇毒磷酸二酯酶或脾磷酸二酯酶水解核酸,分别得到的5'-单核苷酸或3'-单核苷酸混合物,可以用离子交换法分别将各种单核苷酸分离出来。这些单核苷酸是在医药上或在实验室中具有重要应用的化合物。

  34. 思考题 1. 计算一个编码50kd蛋白质基因的外形长度。（A）若DNA呈B-DNA的构象；（B）若DNA呈A-DNA的构象。 2. 将一环状DNA的超螺旋形和它的松弛形比较，超离心时哪种形式沉降更快？能通过超离心来区分负的和正的超螺旋吗？ 3. 如果你发现一种能切开C2'—C3'键的酶，这个酶能影响DNA的超螺旋结构吗？ 4. 假设一闭合环状双股DNA由100个C和G交替出现的bp组成，当把它转移到高盐溶液中时，经受由B-型向Z-型转换。它的缠绕数、连环数以及超螺旋数会发生什么样的变化？ 5. 有两个DNA片段，它们都由1000bp组成。一个片段含有27%的T，另一个片段含有40%的T。在同样的条件下比较它们两者的解链温度。 6. 如果降低介质中的离子强度，将会对双螺旋DNA的解链曲线有何影响？如果向介质中加入少量的酒精呢？

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