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Presentation Transcript

  1. Engineering antibody • http://home.dlmedu.edu.cn/documents/immuno/yjs_05.ppt#358,2,幻灯片 2

  2. Paul Ehrlich, 1908, production of antibody Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody Emil von Behring, 1901, antitoxins Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene Nobel Prize winners

  3. 免疫学背景知识 免疫——抗原物质进入机体,激发免疫系统发生一系列反应以排除抗原的过程。 先天免疫:是指机体对进入体内的抗原物质的一种无选择性排斥、 清除功能。这是生物体在种系发育的长期过程中逐步建立起来的。 适应性免疫:适应性免疫是被T淋巴细胞和B淋巴细胞介导的免疫,其特征为特异性和记忆性。 体液免疫:B细胞活化产生特异性抗体发挥免疫效应。 细胞免疫:特异性T细胞活化发挥免疫效应。

  4. 完全抗原、不完全抗原 完全抗原——具有免疫原性,同时又具有反应原性的物质称为完全抗原,如异种血清蛋白。 不完全抗原——只有反应原性而无免疫原性的物质称为半抗原或不完全抗原。半抗原分子量很小,本身没有免疫原性,但与蛋白载体结合后可获得免疫原性。

  5. 免疫原性和反应原性 免疫原性(immunogenicity)——指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。 反应原性又称抗原性——指能与由它刺激所产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应。

  6. TD 、 TI抗原 • 根据抗原刺激B细胞产生抗体是否而要T细胞协助分类,可分为胸腺依赖性抗原(TD-Ag)和胸腺非依赖性抗原(TI-Ag)。 • TD-Ag是指需要T细胞辅助和巨噬细胞参与才能激活B细胞产生抗体的抗原性物质。TD抗原免疫应答特点:能引起体液免疫应答也能引起细胞免疫应答;产生IgG等多种类别抗体;可诱导产生免疫记忆。 • TI-Ag是指无需T细胞辅助可直接刺激B细胞产生抗体的抗原,特点:只能引起体液免疫应答;只能产生IgM类抗体;无免疫记忆。

  7. TI-1、TI-2和TD抗原体液免疫应答的区别 T细胞(胸腺)非依赖性抗原_TI; thymus-dependent antigen, TD抗原 B细胞对不同抗原应答的区别

  8. 抗体分子结构 抗体——免疫球蛋白(immunoglobulin),B淋巴细胞产生; 免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类; IgG,IgD,IgE均为单体,分泌液中IgA(SIgA)是双体,IgM是五聚体; Ig重链的分子质量为50—75kh,由450~550个氨基酸残基组成。重链有5种,分别是μ、δ、γ、α和ε链,这五种重链决定了Ig的类别或同种型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。 Ig轻链的分子质量约25kDa,约含210个氨基酸残基。轻链有两种:κ链和λ链,这两种轻链决定了Ig的型别。

  9. Fab(结合抗原)片段

  10. Fab(结合抗原)片段 Fc(fragment crystalizable, 可结晶片段)。

  11. 重链可变区(VH),重链恒定区(CH);轻链可变区(VL),轻链恒定区(CL)。重链可变区(VH),重链恒定区(CH);轻链可变区(VL),轻链恒定区(CL)。

  12. CDR:互补决定簇 Complement Determinant Region Ag-Ab reactions is one of a key (i.e. the Ag) which fits into a lock (i.e. the Ab).

  13. the antibody molecular surface, with the PorA antigen superimposed. Close up of a hydrogen bond – The Tyr 101 of the antibody forms a hydrogen bond with the Gln 121 of the antigen

  14. CDR Epitope Representation of the disassociation of an antibody (top) and antigen (botton) molecule.

  15. IgM/IgD Ig Class (Isotype) Switching Plasma cells Proliferating B cell (centrocytes) Activated B cell (centroblast) IgG2 or IgG3 IFN- IgA or IgG2b TGF- IL-2 IL-4 IL-5 IgE or IgG2 IL-4 IL-2 IL-4 IL-5 IgM Proliferation cytokines IL-2,IL-4,IL-5 Differention cytokines IL-2,IL-4,IL-5,IFN-,TGF-

  16. Ig类型转换(class switch)或称同种型转换(isotype switch)是指一个B淋巴细胞克隆在分化过程中VH (重链可变区)基因片段保持不变,而发生CH(重链恒定区)变化。 • RNA的不同剪接:除DNA水平的Ig类型转换形式外,RNA水平的不同剪接(alternative RNA splicing)也可产生不同的Ig类型。

  17. Ig类转换

  18. 抗体基因重排http://www.med126.com/edu/200712/18453.shtml抗体基因重排http://www.med126.com/edu/200712/18453.shtml 抗体的L链是由C、V、J三个基因簇编码的, H链由C、V、D、J四个基因簇编码的。 V是编码可变区,有300个种类; D编码高变区,有15 ~ 20个种类; J编码连接V、C的结合区,有4~5个种类; C编码恒定区,仅有一种。 这些外显子通过多种多样的重排,所合成出的肽链,还要再进一步进行L和H链组合,这样最后生成的抗体种类就非常多了。 抗体基因重排是发生在淋巴细胞分化的时候。

  19. 抗体的生物学活性 (1)特异性结合抗原:抗体本身不能直接溶解或杀伤带有特异抗原的靶细胞,通常需要补体或吞噬细胞等共同发挥效应以清除病原微生物或导致病理损伤。抗体可通过与病毒或毒素的特异性结合直接发挥中和病毒的作用。 (2)激活补体:IgM、IgG1、IgG2和IgG3可通过经典途径激活补体,凝聚的IgA、IgG4和IgE可通过替代途径激活补体。 补体:可辅助和补充特异性抗体,介导免疫溶菌、溶血作用的血清蛋白。 (3)结合细胞:不同类别的免疫球蛋白可结合不同种的细胞参与免疫应答。。 (4)可通过胎盘及粘膜:IgG能通过胎盘进入胎儿血流中使胎儿形成自然被动免疫。IgA可通过消化道及呼吸道粘膜,是粘膜局部抗感染免疫的主要因素。

  20. (5)具有抗原性:抗体分子是一种蛋白质,也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子,各具有不同的抗原性。(5)具有抗原性:抗体分子是一种蛋白质,也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子,各具有不同的抗原性。 (7)通过与细胞Fc受体结合发挥多种生物效应: 调理作用 ——IgG、IgM的Fc段与吞噬细胞表面的FcγR、FcμR结合,增强其吞噬能力,通常将抗体促进吞噬细胞吞噬功能的作用称为抗体的调理作用 (opsonization)。 细胞毒作用—— 发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。

  21. 发现抗体意义1.证明适应性免疫应答具有记忆性;2.是疫苗接种的理论基础;3. 治疗和检测疾病。

  22. 二、细胞工程抗体和基因工程抗体 抗体技术的发展经历了三个阶段 第一代:多克隆抗血清 第二代:细胞工程抗体(单克隆抗体) 第三代:基因工程抗体

  23. 球蛋白 白蛋白 g b a1 a2 (a) (b) (c) 1 多克隆抗血清 对健康人用疫苗进行主动免疫,免疫前(a)和免疫后10天 (b)分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的g 球蛋白条带较宽,免疫之后则相对集中。

  24. 多价抗原 (致敏的B细胞) 多克隆抗体

  25. 2 单克隆抗体 基本原理 细胞工程抗体——杂交瘤-单克隆抗体

  26. 致敏的B淋巴细胞 杂交瘤 骨髓瘤细胞

  27. HAT: 次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) HGPRT:次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 氨基喋呤阻断DNA合成

  28. 第一次筛选的原理与方法: • 细胞中的DNA合成有两条途径:一条途径是生物合成途径(“D途径”),即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的“D途径”。 • 另一条途径是应急途径或补救途径(“S途径”),它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。

  29. 在HAT培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因B细胞缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡。在HAT培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因B细胞缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡。 骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型(HGPRT)细胞,因此自身没有“S途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。 惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来,并不断增殖。

  30. 第二次筛选的原理和方法:在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且每种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。第二次筛选的原理和方法:在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且每种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。 • 通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞(理论上30%的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞),再由这些单细胞克隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。

  31. 多克隆抗体临床治疗的问题 • 鼠源性——导致人产生抗体, 药物耐受; • 用于检测比较好。

  32. 3 基因工程抗体 通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体

  33. (1) 小分子抗体 Fab(结合抗原)片段 2 1 3

  34. I Fab antibody molecule Pr VH CH1 Pr VL CL 免疫球蛋白 基因载体的构建 L链表达载体 H链表达载体 共转染细胞 图5 Fab 抗体分子的制备

  35. 抗体分泌细胞 VH VL CL CH1 -S-S- 图5 Fab 抗体分子的制备

  36. (2) Sc-Fv VH VL 接头DNA (Gly4Ser)3 变性、复性 VH引物 VL VL引物 VH 接头DNA PCR 酶切、克隆 图7 ScFv (single chain Fv,scFv )的构建

  37. (2) 抗体融合蛋白 抗原结合部位与生物活性蛋白结合 免疫导向 免疫桥连 嵌合受体 含Fc段的抗体融合蛋白—免疫黏附素 Fc的作用:检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能 Fc(fragment crystalizable, 可结晶片段)。

  38. Fc的作用:检测、纯化、 thrombin SPA Fc protein

  39. G-CSF Fc Fc的作用:延长血清中半寿期 DNA ligation expression Fusion Protein

  40. 人-鼠嵌合抗体 嵌合抗体(chimeric antibody):在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起,所产生的抗体含有70-80%的人Ig分子的序列,在很大程度上减少了单克隆抗体的免疫原性,但这种抗体尚存20-30%的鼠源成分,在实际应用过程中仍可刺激机体产生较强的抗独特型反应。

  41. 人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略 Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL 启动子 免疫球蛋白 基因载体的构建 L链嵌合载体 H链嵌合载体 共转染细胞

  42. 抗体分泌细胞 鼠VL 鼠VH 人CL 人CH 人-鼠嵌合基因工程抗体

  43. 人改型抗体(CDR移植) 鼠单克隆抗体V区的人源化 人源化抗体(humanized antibody)又称CDR移植抗体(CDR grafting antibody)

  44. CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体 人源化抗体(改型抗体) 图4 鼠单克隆V区人源化(CDR移植)

  45. 三 基因工程方法研制新的单抗 抗体库技术 • 抗体库——在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire) • 通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因

  46. 抗体库技术产生的三项技术基础  RT-PCR:能够克隆全套抗体可变区基因  抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达  噬菌体展示技术(phage display)