Diagnóstico de Laboratorio por Citometría de Flujo

1. Diagnóstico de Laboratorio por Citometría de Flujo Luis Pistaccio. Hospital de Niños “Sor María Ludovica”. La Plata. La Plata 13 de Noviembre de 2010

2. Diagnóstico desde el Laboratorio de LA • Morfología. • Citoquímica. • Citogenético. • Biología Molecular. • Citometría de Flujo.

3. Morfología Pte: con palidez, dolor articular, hematomas, fiebre, decaimiento y hepato esplenomegalia. Hemograma : GB: 100.000 /mm3 , Hto: 16 %, Plaq: 15.000 /mm3 . Fla dif 100% linfocitos tipo L1 Consulta hematológica

4. Observación, conocimiento Morfología Pte: dolor articular, fiebre y hepato esplenomegalia. Hemograma : GB: 8.000 /mm3 , Hto: 27 %, Plaq: 150.000 /mm3 . Fla dif 52% linfocitos tipo L1, 38% neutrófilos y 10% monocitos Consulta hematológica

5. Citometría de Flujo Esquema de Componentes Muestra Fluido isotónico Láser Sistema de detectores Celda de conteo

6. Dispersión de luz La dispersión de la luz. Parámetros físicos, (morfométricos). Propiedades intrínsecas. • Forward Scatter (FSC). Desde 0.5-1° a 10-20°. • Side Scatter (SSC). Aprox. 90° a la derecha del haz incidente. Absorción de luz por fluorocromos pegados a las células y emisión de luz fluorescente. Propiedades extrínsecas ya que es necesario el agregado de un compuesto exógeno. • Fluorocromos unidos a Ac Mo. • Fluorocromos que se unen a componentes celulares.

7. Citometría de Flujo 1 láser 3 colores SSC FL1 Data Processor FL2 FSC Time FL3 Time Time

8. 3 lásers 8 colores SSC FL1 FSC FL2 FL3 Data Processing FL4 FL5 FL6 FL7 FL8

9. Histograma Positividad Count FL 1

10. Histograma Positividad Count FL 1 Intensidad de fluorescencia

11. Histograma de dos parámetros (Quad-stat) B1 B2 FL1 B3 B4 FL2 B1 positivo para FL1 B2 Doble positivo B3 Doble negativo B4 Positivo para FL2

12. APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A. • Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide. • Subclasificación inmunológica de LLA B y T. • Diagnóstico de línea de LMA. • Detección de LLA hiperdiploides. • Detección de proteinas de fusión. • Detección de EMR.

13. Diagnóstico: M.O. normal • Linfocitos • Monocitos • Mieloide madura • Mieloide inmadura • Eritroide

14. Diagnóstico: Leucemia Aguda

15. Diagnóstico • En general la población a estudiar es un porcentaje considerable (20 %). • Alteración de la distribución normal de los componentes de la MO. • Aparición de una población con inmunofenotipo anómalo. • Asignación de linaje según inmunofenotipo obtenido.

16. APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A. • Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide. • Subclas. Inmunológica de LLA B y T • Diagnóstico de línea de LMA. • Detección de LLA hiperdiploides. • Detección de proteinas de fusión. • Detección de EMR.

17. Clasificación LLA de precursores B cCD22+, cCD79a+, CD19+, HLA-DR+ Pro B: CD10 - Común: CD10+, cad  - Pre B: CD10+/-, cad  +, Ig Sup - B madura: CD10+/-, Ig Sup+ (  ó ) Clasificación EGIL

18. Clasificación LLA de precursores T cCD3+, CD7+,TCR+/-, HLA-DR- Pro T: CD2 -, CD5 - , CD8 - Pre T: CD2+,y/o CD5+ y/o CD8+ Intermedia:CD1a+,CD4+/CD8+,CD3+/- T madura: CD1a-, CD3+ , TCR / Clasificación EGIL

19. APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A. • Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide. • Subclas. Inmunológica de LLA B y T • Diagnóstico de línea de LMA. • Detección de LLA hiperdiploides. • Detección de proteinas de fusión. • Detección de EMR.

20. LMA

21. Diagnóstico de Linaje en LMA • La correlación con la clasificación FAB es limitada. • Hasta hace unos años sólo diagnóstico en M0 y M7. • Al aumentar el número de fluorocromos y los Ac Mo disponibles mayor capacidad diagnóstica. • Correlación inmunofenotipo-genotipo.

22. Score EGIL Puntuación Bifenotípicas Linaje B Linaje T Linaje mieloide Puntos cCD79a cCD3 aMPO 2 cIgM TCR 2 cCD22 TCR 2 CD19 CD2 CD13 1 CD20 CD5 CD33 1 CD10 CD8 CD117 1 Tdt Tdt CD14 0.5 CD7 CD15 0.5 CD1a CD64 0.5 Para asignar un linaje determinado a los blastos, el score debe ser >2 Una LA se define como bifenotípica si el puntaje resulta >2 para más de un linaje

23. APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A. • Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide. • Subclas. Inmunológica de LLA B y T • Diagnóstico de línea de LMA. • Diagnóstico de LLA hiperdiploides • Detección de proteinas de fusión. • Detección de EMR.

24. Indice de ADN Importante en pronóstico de LLA.

25. APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A. • Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide. • Subclas. Inmunológica de LLA B y T • Diagnóstico de línea de LMA. • Diagnóstico de LLA hiperdiploides • Detección de proteinas de fusión. • Detección de EMR.

26. APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A. • Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide. • Subclas. Inmunológica de LLA B y T • Diagnóstico de línea de LMA. • Diagnóstico de LLA hiperdiploides • Detección de proteinas de fusión. • Detección de EMR.

27. EMR: DEFINICION Enfermedad indetectable a la microscopía óptica, que puede expandirse en cualquier momento, haciéndose evidente como una recaída de la enfermedad. (Foroni et al. 2002). Consiste en la permanencia de un clon anormal, en cantidades indetectables para la microscopía óptica, durante o al finalizar el tratamiento. Actualmente es un pilar básico para: • Seguimiento de la enfermedad. • Diagnóstico precoz de recaída. • Conducta pretransplante.

28. ALLIC BFM 2010: Clasificación EDAD 1-5a GB <20 x 109/L BLASTOS D8 <1000 EDAD <1 ≥6a GB ≥20 x 109/L BLASTOS D8 <1000 t(9;22) t(4;11) BLASTOS D8 ≥1000 HIPODIPLOIDIA ERM Día 15 <0.1% >01- <10% >01- <10% >10% TODAS >10% M1/M2M3 M1/M2M3 M1/M2/M3 M1M2/M3 M1M2/M3 M1/M2/M3 DIAGNÓSTICO DIA 8 DÍA 15 DÍA 33 GRUPOSDERERIRA RIESGO 13% 66% 21% RECAÍDAS 5% 22% 40%

29. EMR: Métodos de Detección Sensibilidad Citogenética convencional 10-1 a 10 –2 10-2 10-1 a 10-2 10-1 a 10-4 10-3 a 10-5 FISH Southern Blot Citometría de Flujo Biología Molecular: PCR

30. Citometría de Flujo: Caracterización de blastos en EMR • FSC- SSC particular. • Antígenos: • Aumento de expresión (over expression) • Disminución de la expresión (under expression). • Asincronismo madurativo. • Infidelidad de linaje. • LAIP Inmunofenotipo asociado a Leucemia aguda.

31. CF: LLA Fenotipos aberrantes

32. EMR por CF: conceptos importantes • Panel completo de marcación al diagnóstico para caracterizar al blasto con el fin de optimizar el seguimiento. (LAIP) • Conocimiento de la expresión de los marcadores en MO normales y en MO en regeneración. (Caminos madurativos) • Evaluación de posibles cambios fenotipícos en cada caso. • Evaluación de cambios en la intensidad de expresión por el tratamiento.

33. EMR por CF: ¿Qué paneles utilizar? • Los distintos grupos usan paneles de marcación y de EMR según su experiencia, conocimiento y posibilidades. • La mayoría utiliza una columna (“backbone”) de 2, 3 o 4 marcadores con el mismo fluorocromo (CD45, 19 , 34 y CD10 en LLA B y CD45, CD7, CD3 y/o CD5 en LLA T) que se repite en los distintos tubos. • Los paneles de los distintos grupos son muy similares entre sí.

34. “Flow cytometry for fast and sensitive diagnosis an follow-up of haematological malignancies”

36. Secuencia de Marcación Euroflow.org

38. Blastos LLA linaje B

42. EMR por CF: conceptos importantes • Panel completo de marcación al diagnóstico para caracterizar al blasto con el fin de optimizar el seguimiento. (LAIP) • Conocimiento de la expresión de los marcadores en MO normales y en MO en regeneración. (Caminos madurativos) • Evaluación de posibles cambios fenotipícos en cada caso. • Evaluación de cambios en la intensidad de expresión por el tratamiento.

43. Caminos madurativos y blastos Blastos B Blastos B Diferenciación normal CD20 Blastos B Blastos B CD10

44. Cambios Fenotípicos CD10 Diagnóstico Considerar cambios fenotípicos en las recaídas 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 Día 15 Recaída postTto CD20

45. Modulación con el tratamiento • ALL: drug-induced antigen expression modulationby steroid-containing induction therapy MO SP Typical but not uniform patterns (“normalization”): up: CD11a, CD20, CD45 down: CD10, CD34, TdT CD99 ~ stable: CD19, CD58 Diagnóstico 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 CD19 PC5 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 Seguimiento Día 33 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 CD10 PE Gaipa et al., Leukemia 19: 49 (2005)

46. Modulación con el tratamiento CD 66c CD 34 CD 20 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 Diagnóstico 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 CD 20 CD 66c CD 34 Día 33 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 CD 10

47. Resumiendo... • Actualmente imprescindible Citómetros de al menos 4 colores. • Estudio de inmunofenotipo de M.O. Normales y regenerativas. • Diseñar paneles de tubos que determinen una óptima sensibilidad diagnóstica. • Utilizar paneles de marcación lo más completos posibles.

48. Resumiendo... • Búsqueda de EMR en días preestablecidos del tratamiento. Considerar cambios por el Tto. • Considerar sobreexpresiones, subexpresiones expresión aberrantes e infidelidades de linaje que nos faciliten la tarea en la búsqueda de EMR. • Evaluar posibles cambios fenotípicos en recaídas. • Estandarización del protocolo para el procesamiento de las muestras, el uso de monoclonales, marcas comerciales de Ac Mo y análisis de datos.

49. luisgapistaccio@hotmail.com Muchas gracias por su atención. www.euroflow.org www.cure4kids.org