monitoreo de un proceso de purificaci n de prote nas n.
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Monitoreo de un proceso de purificación de proteínas

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Monitoreo de un proceso de purificación de proteínas. Corrimiento electroforético de las muestras Determinación de la actividad frente a un ligando específico. FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS. Estudia la migración de las particulas coloidales en el seno de un campo eléctrico.

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Presentation Transcript
monitoreo de un proceso de purificaci n de prote nas

Monitoreo de un proceso de purificación de proteínas

Corrimiento electroforético de las muestras

Determinación de la actividad frente a un ligando específico

fundamento de la electroforesis
FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS
  • Estudia la migración de las particulas coloidales en el seno de un campo eléctrico
separaci n de los elementos de una mezcla
SEPARACIÓN DE LOS ELEMENTOS DE UNA MEZCLA
  • Separa los diferentes elementos que componen una mezcla compleja en función de la carga eléctrica de los mismos
migraci n electrofor tica
MIGRACIÓN ELECTROFORÉTICA
  • Es la movilidad de la molécula por unidad de campo eléctrico

-

+

Aplicación

velocidad de las particulas
VELOCIDAD DE LAS PARTICULAS

Depende de ...

  • La carga de las mismas
  • La intensidad del campo eléctrico y
  • Del coeficiente de fricción de las moléculas con el medio
tipos de electroforesis
TIPOS DE ELECTROFORESIS

Libre

Tipos de

electroforesis

Papel

Sobre

soporte

Acetato de celulosa

Almidón

Poliacrilamida

Agar

Gel

qu es la electroforesis
¿Qué es la electroforesis?
  • Es la técnica que permite la separación de proteínas con diferente peso molecular y/o carga eléctrica.
  • Existe diversidad de sistemas electroforéticos:
  • Tubos, placas de vidrio
  • Geles nativos, desnaturalizantes o reductores
  • En primera o segunda dimensión
c mo se separan las mezclas de prote nas en una electroforesis
¿Cómo se separan las mezclas de proteínas en una electroforesis?
  • En base a su carga eléctrica
  • En base a su peso molecular.

Fundamento. Las proteínas tienen una carga eléctrica neta y un peso molecular determinado por lo que al imponer un campo eléctrico las proteínas migraran.

desnaturalizaci n de las prote nas
Desnaturalización de las proteínas
  • Se pueden uniformar las cargas de una proteína, entonces se moverán en el gel en base a su peso molecular
componentes de un gel de acrilamida
Componentes de un gel de acrilamida
  • Acrilamida es la molécula que es polimerizada para dar largas cadenas las cual al ser entrecruzadas constituyen el gel soporte.
  • N, N, Metilenbis acrilamida. Esta molécula entrecrua químicamente las cadenas lineales de acrilamida, originando la malla consistente y porosa
contin a
Continúa..
  • Persulfato de amonio. En soluciones acuosas forma radicales libres, los cuales reaccionan con los monómeros de acrilamida, preservándose en forma de radicales que pueden polimerizarse, es el catalizador.
  • TEMED ((N,N,N,N'-tetrametilnediamina) Existe en forma de radicales libres por lo cual contribuye a la reacción de polimerización acelerándola.
preparaci n de dos geles
Preparación de dos geles

A) el gel separador

B) el gel concentrador

la prote na se mezcla con amortiguador de muestra y se calienta
La proteína se mezcla con amortiguador de muestra y se calienta
  • Calentar la muestra en presencia de SDS ayuda a romper la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína. Pero no rompe los puentes disulfuro.
para romper el puente disulfuro
Para romper el puente disulfuro...
  • Se añaden agentes como -mercaptoetanol o DTT, ambos reducen el puente disulfuro y por tanto la estructurura terciaria o cuaternaria.
como se ver a el corrimiento electrofor tico de una prote na si no usamos dtt
Como se vería el corrimiento electroforético de una proteína si no usamos DTT
  • Cuándo una proteína no tiene puentes disulfuro
hay que conocer las limitantes para la separaci n
Hay que conocer las limitantes para la separación
  • Mucha proteína no deja que se resuelva, es decir se separen las proteínas una de otra.
adem s para visualizar a la prote na hay que escoger el m todo de tinci n adecuado
Además para visualizar a la proteína hay que escoger el método de tinción adecuado.
  • Tinción con plata de geles de proteínas. facilidad de uso y su gran sensibilidad, entre 50 y 100 veces más sensible que la tinción con Azul de Coomasie
  • Tinción con azul de Coomasie.
2d gel electrophoresis
2D Gel Electrophoresis
  • Simultaneous separation and detection of ~2000 proteins on a 20x25 cm gel
  • Up to 10,000 proteins can be seen using optimized protocols
ief principles

Increasing pH

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+

+

+

+

+

+

+

+

+

C

A

T

H

O

D

E

A

N

O

D

E

pI = 8.6

pI = 6.4

pI = 5.1

IEF Principles