1: Laboratorio de Inmunología e Infecciosas orbita.starmedia/~diseases

1. Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y parafinadas. María Lilia Díaz Betancourt1, Liz Betty García1, Ernesto León Rodríguez F2, Julio César Klinger1, Miryam Bravo de Insuasty1 1: Laboratorio de Inmunología e Infecciosas http://orbita.starmedia.com/~diseases Email: diseases@starmedia.com ó mldiaz@emtel.net.co 2: Laboratorio de Bioantropología http://200.21.83.171/antropos Email: antropos@ucauca.edu.co Universidad del Cauca – Popayán, Colombia Palabras claves: PCR, Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, biopsias frescas, biopsias parafinadas,

2. Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y parafinadas. INTRODUCCIÓN... La tuberculosis es la primera causa mundial de muerte por enfermedad infecciosa. El 30% de las población mundial está infectada. En el mundo se enferman 9.000.000 y se mueren 3.000.000 de personas cada año por causa de la tuberculosis. Uno de los problemas que aún existe a pesar de más de 100 años de conocerse el bacilo causante de la tuberculosis, es la baja sensibilidad de los métodos de diagnóstico disponibles.

3. Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y parafinadas. INTRODUCCIÓN... Así la tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes (ZN) requiere de 10.000 micobacterias/ml de muestra para ser positivo y en nuestros tiempos con el creciente número de pacientes inmunodeficientes es inespecífico El cultivo requiere 400 micobacterias/ml de muestra y es necesario esperar mínimo tres semanas y hasta 2 meses para obtener el aislamiento.

4. Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y parafinadas. INTRODUCCIÓN... La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una metodología de Biología molecular. Es una técnica que puede ser aplicada en la identificación de micobacterias, es rápida y más sensible que el cultivo. Consiste en replicar in vitro una secuencia conocida de ADN característica de una determinada célula en este caso solamente presente en micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis de tal manera que al final del procedimiento se obtienen millones de cadenas, visibles fácilmente por diversas metodologías, a partir de unas pocas cadenas que pudieran estar en una muestra clínica.

5. Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y parafinadas. • OBJETIVOS... • Estandarizar y aplicar una prueba de PCR al diagnóstico de tuberculosis en biopsias frescas y parafinadas. • Evaluar la sensibilidad y especificidad.

6. Esquema del PCR Taq polimerasa

7. Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y parafinadas. Materiales y métodos • Cultivo de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) • Biopsias frescas y parafinadas procedentes de • pacientes con sospecha o con tuberculosis • comprobada. • Iniciadores para amplificar un fragmento de 245 pb • de la secuencia de inserción INS6110 presente en • el Complejo Mycobacterium tuberculosis. • INS1:5´CGT-GAG-GGC-ATC-GAG-GTG-GC • INS2:5´GCG-TAG-GCG-TCG-GTG-ACA-AA

8. Materiales y métodos AREA DE EXTRACCIÓN

9. Materiales y métodos Extracción de ADN de Cultivo de M. tuberculosis (H37Rv) • TE 400 µl. • Lisozima al 3.3 % 50 µl, 37 °C, 1h. • SDS al 20% 30 µl, 65 °C, 1h. • Proteinasa K 2 mg/ml 150 µl, 55 °C x 18 horas. • Perclorato de Sodio 3 mM 100 µl, 10`. • Cloroformo - alcohol isoamilico 24:1, 500 µl, 30´. • Centrifugación 14.000 r.p.m 15´. • Sobrenadante + Etanol Absoluto 1.5 ml + Acetato de Sodio 30 µl. • Refrigeración a -20 °C, 2 h. • Centrifugación 14.000 r.p.m 15´. • Suspensión en agua destilada y desionizada. • Cuantificación 260 nm.

10. Materiales y métodos AREA DE AMPLIFICACIÓN

11. Materiales y métodos Amplificación de ADN de cultivo de M. tuberculosis (H37Rv) Mezcla: • Iniciadores • INS1 - 5´ CGTGAGGGCATCGAGGTGGC - 3´ • INS2 - 5´ GCGTAGGCGTCGGTGACAAA - 3´ • TE 10x Buffer 5 µl. • ClMg 25 nM 4 µl. • Dionucleotidos trifosfatados 2.5 nM. • Formamida 0.5 µl. • ADN. • Agua destilada y desionizada. Volumen total 50 µl.

12. Materiales y métodos Amplificación de ADN de cultivo de M. tuberculosis (H37Rv) Condiciones: Desnaturalización 5´ 95°C Taq Polimerasa 0.5 ud, 4°C Desnaturalización 4´ 95°C Desnaturalización 2´ 95°C Hibridización 2´ 67°C Extensión 2´ 72°C* Extensión final 10´ 72°C 35 Ciclos * 5” de aumento en cada ciclo.

13. Materiales y métodos Electroforesis del ADN Separación de los productos de PCR en gel de agarosa al 1.5%, y visualización mediante luz ultravioleta después de la tinción con bromuro de etidio a 0.5 µg/ml.

14. Materiales y métodos Electroforesis en gel de agarosa a 40 vol. durante 3 horas

15. Materiales y métodos Extracción de ADN de biopsias • Desparafinación: 2 fragmentos de 10 µm • Xilol 500 µl, 55 ºC, 15´ x 2 veces. • Etanol 500 µl al 75% x 2 veces. • Secado • Suspensión de la biopsia desparafinada o fresca en 400 µl de TE. • Lisozima al 3.3 % 50 µl, 37 °C, 1h. • SDS al 20% 30 µl, 65 °C, 1h. • Proteinasa K 2 mg/ml 150 µl, 55 °C x 2 horas. • Perclorato de Sodio 3 mM 100 µl, 10`.

16. Materiales y métodos Extracción de ADN de Biopsias • Cloroformo - alcohol isoamílico 24:1, 500 µl, 30´. • Centrifugación 14.000 r.p.m 15´. • Sobrenadante + Etanol Absoluto 1.5 ml + Acetato de Sodio 3 mM 30 µl. • Refrigeración a -20 °C, 2 h. • Centrifugación 14.000 r.p.m 15´. • Suspensión en agua destilada y desionizada. • Cuantificación 260 nm.

17. Materiales y métodos Amplificación de ADN de biopsias Mezcla: • Iniciadores • INS1 - 5´ CGTGAGGGCATCGAGGTGGC - 3´ • INS2 - 5´ GCGTAGGCGTCGGTGACAAA - 3´ • TE 10x Buffer 5 µl. • ClMg 25 nM 4 µl. • Dionucleotidos trifosfatados 2.5 nM. • Formamida 0.5 µl. • ADN 1 µg. • Agua destilada y desionizada. Volumen total 50 µl.

18. Materiales y métodos Amplificación de ADN de biopsias Condiciones: Desnaturalización 5´ 95°C Taq Polimerasa 0.5 ud, 4°C Desnaturalización 4´ 95°C Desnaturalización 4´ 95°C Hibridización 2´ 67°C Extensión 2´ 72°C* Extensión final 10´ 72°C 45 Ciclos * 5” de aumento en cada ciclo.

19. Resultados Sensibilidad en ADN del cultivo de Mycobacterium tuberculosis 1 2 3 4 5 6 7 • 2 µg, • 1 µg, • 500 fg, • 10 fg, • 1 fg. • Sin ADN, • Marcador de peso molecular 245 pb. Las lineas muestran diferentes cantidades de ADN de cultivo de Mycobacterium tuberculosisamplificado.

20. Resultados Especificidad del PCR en ADN de diferentes células 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 La lineas muestran 1µg de ADN amplificado procedente de diferentes células 240pb 1) SinADN 2) M. tb H37Rv 3) M. bovis 4) M. kansassi 5)M. avium-intracelular 6)Histoplasma sp 7) E coli 8) Linfocitos humanos 9) Sin ADN 10) Marcador de peso molecular ladder123 pb

21. Resultados del PCR en biopsias frescas y parafinadas. Grupos Frescas Parafinadas Nº (% PCR+) Nº (% PCR+) Establecida 4 (75) 10 (100) Probable 5 (80) 14 (86) No TBC 4 (25) 7 (0)

22. Resultados del PCR en ADN de biopsias parafinadas La lineas muestran 1µg de ADN amplificado procedente de diferentes biopsias parafinadas. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 245pb 1) SinADN 2) Endometrio, probable TB 3) Escroto TB 4) Ganglio linfático 5) Pleura probable TB 6) Biopsia control positívo 7) Biopsia control negatívo 8) ADN Mt.b 9) Control de contaminación de extracción 10) Sin ADN 11) Marcador de peso molecular 245 pb

23. Resultado del PCR en ADN de biopsias frescas La lineas muestran 1µg de ADN amplificado procedente de diferentes biopsias frescas. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 245pb 1) SinADN 2) Peritoneo TB 3) Ganglio linfático, Linfoma 4) Piel, Esporotricosis 5) Pleura, probable TB 6) Exocervix, probable TB 7) Biopsia control positívo 8) Biopsia control negatívo 9) ADN Mt.b 10) Control de contaminación de extracción 11) Sin ADN 12) Marcador de peso molecular 245 pb

24. Análisis estadístico para resultados del PCR en biopsias frescas y parafinadas. TB Prob. TB Sensibilidad 93% 84% Especificidad 91% 91% VPP 93% 94% VPN 92% 79%

25. Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y parafinadas. • CONCLUSIONES... • Con nuestra prueba es posible estudiar tejidos frescos y parafinados procedentes de sitios con sospecha de enfermedad tuberculosa, en busca de secuencias del ADN del complejo Mycobacterium tuberculosis con una sensibilidad del 93% en tuberculosis establecida y del 84% en tuberculosis probable. Una biopsia de ganglio linfático cervical fresca se encontró ZN positiva y PCR negativa. El cultivo de esta biopsia fue negativo. Aunque podría este, ser un falso negativo del PCR por inhibición de la prueba lo cual no fue buscado, bien podría tratarse de infección por micobacterias no tuberculosas las cuales no son amplificadas por nuestra prueba que sólo detecta ADN del complejo Mycobacterium tuberculosis, caso en el cual la sensibilidad sería del 100% en tuberculosis establecida.

26. Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y parafinadas. • CONCLUSIONES... • De otro modo nuestra prueba adelanta el diagnóstico de la tuberculosis establecida por cultivo ya que el procedimiento se demora 2 días mientras el cultivo 3 a 8 semanas. • El PCR permitió establecer el diagnóstico en lesiones granulomatosas con cultivo y tinción negativa con una especificidad del 91%, y en este grupo de pacientes se constituiría en una prueba de gran ayuda para el tratamiento de la gran mayoría de ellos con un valor predictivo positivo del 79%.

27. Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y parafinadas. • BIBLIOGRAFIA... • 1 Jereb, J.A.; Kelly, G.D.; Dooley, S.W; Cauthen, G.M.; Snider, D.E. Tuberculosis, morbidity in the United States: Final data, 1990. MMWR 1991; 40 (ss-3): 23-28. • 2Mandel, G.L., J.E. Bennett and R. Dolin. Principles and practice of Infectious Diseases, 4a Ed. Churchill Livingstone Inc. N.Y. 1995; 2231. • 3 Cañas G., L.M. Tuberculosis de difícil diagnóstico: Factores condicionantes en el Hospital Universitario San José de Popayán. Tesis para optar el título de Especialista en Medicina Interna 1993. Biblioteca Ciencias de la Salud, Universidad del Cauca, Popayán. • 4 Hance, A.J.; Grandchamp, B.; Frébault, V.L.; Lecossier, D.; Rauzier, J; Bocart, D.; Gicquel, B. Detection and identification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA. Molec. Microbiol. 1988; 3: 843-849.

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