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In-line Tissue Engineering approach . Fabrizio Raimondi – Stefano Pagnutti. Biella 5 giugno 2009. La perdita o l’insufficienza funzionale di un tessuto o di un organo rappresentano uno dei problemi più invalidanti, frequenti e costosi nell’ambito della sanità.

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Presentation Transcript
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In-line

Tissue Engineering

approach

Fabrizio Raimondi – Stefano Pagnutti

Biella 5 giugno 2009


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La perdita o l’insufficienza funzionale di un tessuto

o di un organo rappresentano uno dei problemi

più invalidanti, frequenti e costosi

nell’ambito della sanità.

Il problema non è esclusivamente limitato

alla mancanza di organi in toto

- fegato, rene, cuore, pancreas -

ma coinvolge anche deficit tissutali localizzati

e limitati a parti di non vitale importanza

che comunque determinano

una scarsa qualità della vita.


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Mentre la perdita di un organo

viene necessariamente compensata con un trapianto,

nel caso di perdite di sostanza

il chirurgo deve ingegnarsi su come ricostruire,

utilizzando i tessuti residui

o con ciò che viene messo a disposizione

dalle industrie dei biomateriali,

la struttura e la funzione

dei tessuti danneggiati.


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Biomateriali improvvisati e tentativi di riparazione

sono antichi come il desiderio e la necessità dell’uomo di sostituire parti del corpo difettose

per migliorare la qualità della vita.

PASSATO


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Papiro di Edwin Smith (1850)

48 casi clinici:

27 traumi cranici;

6 lesioni della gola e del capo;

2 della clavicola;

3 delle braccia;

8 dello sterno;

1 della spalla;

1 della colonna vertebrale.

Alluce in cuoio e legno Sacerdotessa di Tebe (1.000 a.C.)

(Museo del Cairo)

2600 a.C. Sacerdote, ufficiale, costruttore e architetto visse alla corte del faraone Djoser (III Dinastia). Quasi universalmente riconosciuto come

il “Padre della Medicina”

Chiodo di 23 cm

in ferro inserito

nel ginocchio.

Mummia di Usermontu

(656-525 a. C.)

(Museo di San Josè, CA)

1700 a.C. The Edwin Smith Surgical Papyrus

Lungo 4.68 metri e largo 33 cm, fu scritto sulla base di testi più antichi di circa 1000 anni

NASCE LA MEDICINA


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Mandibola trovata in Honduras

nel 1931, presenta tre frammenti

di conchiglia in luogo degli incisivi inferiori.

Databile intorno al 600 d.C.

Protesi dentaria dei Fenici costituita da conchiglie legate con filo d’oro (V-VI sec. a.C.)

Canino legato con filo dìoro a due incisivi

(Cairo)

Incisivo artificiale

(tomba etrusca)

LE PRIME PROTESI


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I santi Cosma e Damiano attorno al 300 avrebbero attaccato la gamba di un moro ad un cristiano.

“El milagro de Calanda”

Atti notarili e processuali testimoniano lo strano reimpianto di gamba di Miguel Juan Pellicer nel 1640 a Calanda (Bassa Aragona, Spagna)

MIRACOLI


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Nel 1668 il medico olandese Job Van Meekeren esegue il primo innesto osseo eterologo innestando un frammento di cranio di cane in un difetto craniale di un soldato rimasto ferito.

Il soldato venne scomunicato. Per questo chiese di farsi togliere l’innesto, ma non fu possibile perché risultò completamente integrato.

(De Boer 1988)

IL PRIMO INNESTO ETEROLOGO


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Antoni Van LeeuwenhoeK nel 1674 descrive per la prima volta la struttura ossea relativamente a quelli che saranno poi chiamati canali Haversiani.

Si cominciano ad evidenziare concetti come “callo osseo”, “impianto” e “riassorbimento”.

Nel 1743 Duhamel pubblica i risultati dei suoi esperimenti su animale dove suggerisce il ruolo importante del periostio nella neo-osteogenesi.

(De Boer 1988, Glicenstein 2000)

LA STRUTTURA DELL’OSSO


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Il primo innesto autologo Germania 1820: Philips Von Walter chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

Leopold Ollier

studia il fenomeno della rigenerazione ossea

e pubblica nel 1861 il

“traité de la régénération des os” documento in cui compare per la prima volta il termine “greffe osseuse”:

innesto osseo

Il chirurgo scozzese William Mac Ewen nel 1880 innesta un segmento di tibia da donatore in un difetto omerale di un ragazzo.

INNESTO AUTOLOGO E OMOLOGO


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“Riparare” “Rigenerare” chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

Riparazione o sostituzione

di organi e di tessuti rimossi

  • Ripristino di strutture

  • Proprietà biomeccaniche

  • Funzione

  • Attività biochimica

PRESENTE E FUTURO… PROSSIMO


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Cellule chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

autologhe

Fattori

di crescita

Scaffold

Ingegneria

Tissutale

Applicazione

clinica

TISSUE ENGINEERING

L’ingegneria dei tessuti è un “campo multidisciplinare”

in cui si fondono biologia cellulare, ingegneria, scienza dei materiali e chirurgia, allo scopo di costruire nuovi tessuti funzionali, mediante la combinazione di:


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scaffold chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

host

tissue

SEMPLICEMENTE

“…the science of persuading the body to regenerate or repair tissues that fail to regenerate or heal spontaneously”

C. M. Agrawal

Solo scaffold

Scaffold + fattori di crescita

Scaffold + cellule + fattori di crescita

Scaffold + cellule

Biomaterials Research Group 2004


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Nutrienti bloccati, chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

cataboliti intrappolati

Coagulo

ematico

?

Scaffold

impiantato

Pori

riempiti

di ECM

Adesione di

proteine, GFs,…

Richiamo

e penetrazione

cellulare

Cellule sintetizzano

e depositano matrice

extracellulare (ECM)

Invasione

di vasi

sanguigni

Cellule al centro

MUOIONO

Fallimento

dello scaffold

osso

Cellule aderiscono,

proliferano e

differenziano

BASTA IL SOLO SCAFFOLD?


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SOLO chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

piccoli difetti

< 2-3mm

alternativa

Scaffold

Cellule

Fattori

di crescita

Tissue

Engineering

Tessuto osseo

danneggiato


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Tissue chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

Engineering

Utilizzare i requisiti e i principi dell’ingegneria tissutale, direttamente in sala operatoria

In-line TISSUE ENGINEERING


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  • Necessità di un chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.BIOMATERIALE

  • Fornisce un’impalcatura tri-dimensionale per lo sviluppo delle linee cellulari e la deposizione di matrice extracellulare

  • Svolge un’importante funzione di interazione biologica: comunicazione e scambio di segnali con il tessuto circostante

  • Controllo della struttura e della funzione

  • del tessuto ingegnerizzato

1. LO SCAFFOLD


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BIOMATERIALE IDEALE chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

  • biocompatibile

  • favorire

  • - adesione

  • - migrazione

  • - proliferazione

  • - differenziamento cellulare

  • - sintesi di matrice

  • extracellulare (ECM)

  • - invasione vascolare

  • biodegradabile


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INTERAZIONE CELLULA-BIOMATERIALE chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

La capacità di una cellula di riconoscere ed interagire con il substrato rappresenta il primo indispensabile passo, senza il quale processi come proliferazione, migrazione e differenziamento cellulare non sarebbero possibili.

Nella progettazione di materiali per l’ingegneria dei tessuti, la comprensione dei meccanismi che regolano tale interazione sono di fondamentale importanza.


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RICONOSCIMENTO E ADESIONE chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

Uno dei requisiti fondamentali di un biomateriale

per l’ingegneria dei tessuti è la capacità di

promuovere efficientemente l’adesione

delle cellule da cui verrà colonizzato.

Tale adesione prevede una fase precoce

in cui la cellula riconosce il substrato.

L’adesione cellulare ad un biomateriale avviene

tramite un meccanismo specifico, mediato

da proteine di membrana dette integrine.


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Le integrine trasmettono il segnale dalla superficie cellulare

alla fitta rete di filamenti citoscheletrici che costituiscono l’impalcatura della cellula. Dall’interazione delle integrine

con la matrice si originano cascate di segnali che determinano

la riorganizzazione del citoscheletro di actina

ed il cambiamento della morfologia cellulare.

La cellula, all’inizio tondeggiante (a), assume una forma distesa (b).


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QUALE SCAFFOLD SCEGLIERE cellulare

Sicurezza

Aspetti medico-legali

Innesto omologo

Biocompatibilità

Immunogenicità

Qualità

Innesto eterologo

Porosità

Degradabilità

Innesto di sintesi


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Gli innesti eterologhi prodotti da Bioteck con un sistema esclusivo

di deantigenazione enzimatica a 37° C

sono sicuri, totalmente biocompatibili e con la componente collagenica preservata

PURA MATRICE BIOLOGICA


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Un sistema di demineralizzazione parziale, consente inoltre di avere innesti dalle caratteristiche di flessibilità e plasticità uniche.

La demineralizzazione espone maggiormente la matrice collagene esaltandone così le caratteristiche biologiche.

INNESTI FLEX


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2. I FATTORI DI CRESCITA di avere innesti dalle caratteristiche di flessibilità e plasticità uniche.

Fattori di crescita (growth factors, GFs):

sono polipeptidi che agiscono legandosi generalmente a recettori

ad attività tirosina-chinasica, inducendo una gamma complessa

di risposte che influenzano il destino della cellula bersaglio.

Possono avere unruolo mitogenico(ad es. bFGF sui condrociti)oppuretrofico-differenziativo

(ad es. BMP-1 sulle cellule mesenchimali e pre-osteoblasti).


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  • Autologhi Piastrinici di avere innesti dalle caratteristiche di flessibilità e plasticità uniche.

  • PDGF; TGF-ß1, ß2; IGF I-II; EGF; FGF; VEGF

  • Omologhi

  • innesti a base di DBM/BMP

  • Eterologhi

  • E.M.D – Emdogain® Gel BIORA

  • Colloss®; Targobone®Biomet Biologics.

  • Ricombinanti

  • rhPDGF Regranex®J&J

  • rhBMP7 Osigraft® Stryker Biotech

  • rhBMP2 InductOs®Medtronic

COSA OFFRE IL MERCATO


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3. LA COMPONENTE CELLULARE di avere innesti dalle caratteristiche di flessibilità e plasticità uniche.

  • Staminali(nell’embrione e tessuti adulti)

  • Differenziate(nei tessuti adulti)


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CELLULE STAMINALI di avere innesti dalle caratteristiche di flessibilità e plasticità uniche.

Le cellule staminali (stem cells, SC) sono cellule non specializzate

a uno stadio precoce di sviluppo.

Hanno la caratteristica di riprodursi a lungo senza differenziarsi

(auto-rinnovamento) e di dare origine a cellule progenitrici

dalle quali derivano linee cellulari differenziate

(muscolari, ematiche, nervose, ecc...).

Possono dividersi e differenziarsi in un largo numero di tipi cellulari

che producono i tessuti e gli organi del corpo.

Le prospettive terapeutiche aperte dalle SC risultano straordinarie: un primo campo d’applicazione riguarderà la cura di molte patologie gravi (tumori, malattie ereditarie, malattie neuro-degenerative), un secondo campo d’applicazione riguarderà l’impianto di SC per rigenerare cellule e tessuti evitando così i trapianti di organi e i problemi connessi di scarsità dei donatori e di rischio di rigetto per incompatibilità donatore/ricevente


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  • Le cellule staminali di avere innesti dalle caratteristiche di flessibilità e plasticità uniche.sono cellule non specializzate in grado di dividersi dando origine contemporaneamente

  • ad una cellula staminale (uguale alla cellula madre)

  • ad una cellula precursore di una progenie cellulare

  • che alla fine darà a sua volta origine a cellule terminalmente differenziate (mature).

Staminali

embrionali

Totipotenti

Pluripotenti

Multipotenti

Staminali

fetali / adulte

Unipotenti

Staminali

adulte


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CELLULE STAMINALI ADULTE di avere innesti dalle caratteristiche di flessibilità e plasticità uniche.

  • Presenti nei tessuti adulti

  • Cellule multipotenti che possono essere influenzate dai fattori di crescita (GFs) per differenziare in varie tipologie cellulari mature

  • Ad es. cellule staminali mesenchimali (MSCs) presenti nello stroma del midollo osseo


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Il midollo osseo è attualmente considerato la fonte più abbondante e facilmente disponibile di cellule progenitrici staminali aventi la capacità di auto-rinnovarsi, proliferare, migrare e differenziare in varie tipologie cellulari mature.

In aggiunta alle cellule staminaliematopoietiche, il midollo osseo contiene cellule staminali non-emopoietichemesenchimalie endoteliali, che costituiscono tre “compartimenti staminali” altamente integrati tra loro.

CELLULE STAMINALI NEL MIDOLLO OSSEO


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Caplan AI. abbondante e facilmente disponibile di Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics. Tissue Eng. 2005 Jul-Aug;11(7-8):1198-211. Review

MSCs:

CONCENTRAZIONE MIDOLLARE FISIOLOGICA

In condizioni fisiologiche, il midollo osseo di un uomo adulto

contiene mediamente 1 MSC / 250.000 cellule midollari.

Questo numero è strettamente correlato all’età:


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OK abbondante e facilmente disponibile di

3-4X

MSCs:

CONCENTRAZIONE EFFICACE MINIMA

E’ stato dimostrato da vari autori che il midollo osseo in toto contiene una quantità di cellule osteoprogenitrici non sufficiente per garantire una rigenerazione ossea efficace. Per avere un adeguato stimolo osteogenico occorre concentrare il midollo 3-4X.

  • Muschler GF, Matsukura Y, Nitto H, Boehm CA, Valdevit AD, Kambic HE, Davrs WJ, Easley KA, Powell KA. Selective retention of bone marrow-derived cells to enhance spinal fusion.

  • Clin Orthop Relat Res. 2005 Mar;(432):242-51.

  • Ph. Hernigou, MD, A. Poignard, MD, F. Beaujean, MD and H. Rouard, MD. Percutaneous Autologous Bone-Marrow Grafting for Nonunions. Influence of the Number and Concentration of Progenitor Cells. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 2005;87:1430-1437.


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Il sistema più efficace per concentrare e quindi aumentare il rapporto volume/quantità di MSCs dell’aspirato midollare:

CENTRIFUGAZIONE

AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE DI MSCs


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Porta ad una elevata il rapporto volume/quantità di MSCs dell’aspirato midollare:

concentrazione di cellule midollari

in sospensione,

quindi iniettabili

SISTEMA DI CONCENTRAZIONE


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Studi hanno dimostrato che la maggior concentrazione di cellule si ottiene aspirando 2 ml di midollo per sito di prelievo.

Aspiration to obtain osteoblast progenitor cells from human bone marrow: the influence of aspiration volume.

(Muschler GF, Boem C, Easley K. 1997 - J. Bone Joint Surg. Am. 79:1699-1709)

Prima

Dopo

IL SISTEMA MARROW STIM


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VALORI DI CONCENTRAZIONE


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GRAZIE (TNC)


ad