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Next topics…. Schema di uno spettrometro di massa. Computer. Segnale. Sistema di introduzione. Sorgente di ioni. Analizzatore di massa. Rivelatore. Campione. Ioni. Ioni. 10 -5 -10 -8 torr. Campione. Sistema di vuoto. Classificazione delle sorgenti ioniche.

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Schema di uno spettrometro di massa
Schema di uno spettrometro di massa

Computer

Segnale

Sistema di

introduzione

Sorgente

di ioni

Analizzatore

di massa

Rivelatore

Campione

Ioni

Ioni

10-5-10-8 torr

Campione

Sistema di vuoto


Classificazione delle sorgenti ioniche
Classificazione delle sorgenti ioniche

  • Sorgenti “dure” (elevata frammentazione)

    • Ionizzazione elettronica

  • Sorgenti “molli” (bassa frammentazione)

    • Ionizzazione chimica

    • Desorbimento (MALDI, elettrospray)

    • Fotoionizzazione


Sorgenti ioniche
Sorgenti ioniche

Stato del campione Sorgente

Liquido Elettrospray – nanospray

APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

APPI (atmospheric pressure photoionization)

LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm3 min-1.

Se l’eluente è acqua, 0.1 cm3 min-1 = 5.6 mmol min-1 = 135 cm3 min-1 (c.n.)

Nano-HPLC: flussi ~ 10-4 cm3 min-1 0.1 cm3 min (c.n.)


Meccanismo fisico dell elettrospray
Meccanismo fisico dell’elettrospray

L’applicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e’ la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.


Sistema di nebulizzazione elettrospray
Sistema di nebulizzazione elettrospray

Cono di

Taylor

Punta dell’ago


Sistema di desolvatazione per elettrospray
Sistema di desolvatazione per elettrospray

Gocce di

circa 1 µm

Gas didesolvatazione

Gas ditrasporto

Liquido ditrasporto

Campione

Cono di Taylor

Capillare riscaldato

-

+

2-6 kV


Meccanismo di deplezione degli ioni
Meccanismo di deplezione degli ioni

Calore o gas

secco

Soluzione del campione

Spettrometro di massa

4000 V

Pressione atmosferica

Il calore e/o il gas secco causano la

riduzione delle dimensioni delle gocce

Vapori del solvente

Livelli successivi di vuoto(2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr)

Esplosione Coulombiana

Limite di Rayleigh:

Limite di dimensioni della al quale si prevede la frammentazione della goccia.

q2 = 8π2ε0γd3

q = carica totale della goccia ε0 = permittività elettrica del mezzo γ = tensione superficiale della goccia d = diametro della goccia


L elettrospray genera spettri multicarica
L’elettrospray genera spettri multicarica

m/z

La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na+) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma:

(M + H)+, (M + 2H)2+, …, (M + nH)n+


Sorgenti ioniche a desorbimento
Sorgenti ioniche a desorbimento

Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)

  • L’analita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la vaporizzazione dell’analita.

  • Caratteristiche della matrice:

    • Elevata assorbività alla lunghezza d’onda del laser.

    • Massa molare abbastanza bassa da sublimare facilmente.

    • Bassa reattività chimica.

    • Stabilità al vuoto.

  • Le matrici più utilizzate sono acidi aromatici


Il processo maldi
Il processo MALDI

Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che viene assorbito dalla matrice e provoca la formazione di un plasma contenente gli atomi dell’analita ed atomi e ioni della matrice.


Maldi tof ms
MALDI-TOF MS

Range di massa fino a 106 Analizzatore a tempo di volo.


Lo spettro di massa
Lo spettro di massa

Intensità relativa

m/z

Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS)

Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli


Maldi vantaggi e limitazioni
MALDI: vantaggi e limitazioni

  • Poco sensibile alle contaminazioni (sali, tamponi, detergenti ecc.) Solitamente non richiede complessi passaggi di purificazione del campione.

  • Può analizzare velocemente miscele complesse di analiti (lo spettro è facile da interpretare)

  • Non è una sorgente a flusso

  • La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti può dare luogo ad interferenze.

  • L’analisi quantitativa è limitata dalla ridotta omogeneità del campione.


Schema di uno spettrometro di massa1
Schema di uno spettrometro di massa

Computer

Segnale

Sistema di

introduzione

Sorgente

di ioni

Analizzatore

di massa

Rivelatore

Campione

(gassoso)

Ioni

Ioni

10-5-10-8 torr

Campione

Sistema di vuoto


Risoluzione
Risoluzione

La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come:

R = m/Δm

dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi).

Due picchi sono considerati separati se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%).

Uno spettrometro con una risoluzione di 4 000 risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01).

Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e 500 000.


Risoluzione1
Risoluzione

Picchi risolti al 10% della valle

Intensità

Picchi risolti al 80% della valle

Definizione alternativa

La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dell’altezza.

Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.


Classi di analizzatori di massa
Classi di analizzatori di massa

  • A settore magnetico

  • A doppia focalizzazione

  • A quadrupolo lineare (Q)

  • Trappola ionica a quadrupolo (QIT)

  • A tempo di volo (TOF)

  • A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)


Analizzatore di massa a quadrupolo
Analizzatore di massa a quadrupolo

Potenziale nel quadrupolo


Traiettorie dello ione
Traiettorie dello ione

piano xz

piano yz

piano xz

Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y

piano yz

Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y


Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo
Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo

Moto degli ioni in direzione z

Moto degli ioni in direzione r

tempo

Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.


Analizzatore di massa a quadrupolo1
Analizzatore di massa a quadrupolo

  • Massimo valore m/z ~ 4 000

  • Risoluzione ~ 3 000

    • I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione

    • Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa.

  • Leggero, di dimensioni contenute

  • Facile da accoppiare alla cromatografia

  • Efficiente trasmissione degli ioni

  • Necessaria una elevata precisione nell’allineamento delle barre degli elettrodi


Analizzatore a tempo di volo tof
Analizzatore a tempo di volo (TOF)

Zona di accelerazione con campo elettrostatico E

Ioni positivi

Sorgente

d

V = 0

dE = V0 = 20 000 V

V = V0

L


Analizzatore di massa a tempo di volo
Analizzatore di massa a tempo di volo

  • Massimo valore m/z > 200 000

  • Risoluzione fino a 105.

  • Il reflectron consente di:

    • Ridurre le dimensioni

    • Aumentare la risoluzione

  • Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate

  • Efficiente trasmissione degli ioni

  • Per la doppia spettrometria di massa può essere accoppiato con altri analizzatori (qTOF)


Principi della icrft ms
Principi della ICRFT MS

Gli ioni in un campo elettromagnetico si muovono su traiettorie circolari (o a spirale), generando esse stesse una radiazione elettromagnetica.

Tale r.e.m. può essere rivelata da un’antenna, generando un segnale che contiene le radiofrequenze di tutti gli ioni in funzione del tempo.

Mediante trasformata di Fourier il segnale viene passato dal dominio del tempo al dominio delle frequenze, e di conseguenza al dominio delle masse.


Analizzatore a risonanza ciclotronica
Analizzatore a risonanza ciclotronica

Piano di ricezione

Piano di emissione


Analisi di massa a trasformata di fourier
Analisi di massa a trasformata di Fourier

Segnale nel dominio del tempo

Segnale trasformato nel dominiodelle frequenze  m/z


Analizzatore di massa a icr ft
Analizzatore di massa a ICR FT

  • Massimo valore m/z > 50 000

  • Risoluzione fino a 106.

  • Possibilità di confinare gli ioni per la MS/MS.

  • Massima accuratezza nella determinazione delle masse.

  • Semplicità nel passaggio da ioni positivi a ioni negativi.

  • Prezzi ancora proibitivi per molte applicazioni (500 –1 400 k€)


Doppia spettrometria di massa ms ms
Doppia spettrometria di massa (MS/MS)

Ionizzazione eframmentazione

analisidi massa

m1

analisidi massa

m1

decomposizione

m/z

m/z


Applicazioni della ms ms
Applicazioni della MS/MS

  • Maggior contenuto di informazioni

  • Studio della struttura

    • Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione

  • Rivelazione selettiva di uno ione

    • Drastica riduzione delle interferenze

  • Studio delle reazioni ione-molecola


Ms ms nello spazio e nel tempo
MS/MS nello spazio e nel tempo

Cella dicollisione

MS/MS nello spazio

Tempo 1

Tempo 2

Tempo 3

MS/MS nel tempo

Scansione delloione prodotto

Selezione m/z

Scansione


Combinazioni strumentali per ms ms
Combinazioni strumentali per MS/MS

  • MS/MS nello spazio

    • Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4).

    • Triplo quadrupolo: QqQ

    • Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF.

    • Analizzatori ibridi: EBqQ

    • QqTOF

  • MS/MS nel tempo (MSn)

    • Trappola ionica a quadrupolo (max MS8)

    • Risonanza ciclotronica (ICR FTMS)

    • Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo


Modalit di scansione ms ms
Modalità di scansione MS/MS

Analizzatore di massa fisso

Spettrometro di massa a scansione

Scansione dello ione prodotto

Scansione dello ione precursore

Scansione di perdita neutra

Monitoraggio di reazione selezionata

Scansione dello ione prodotto

Selezione m/z

Scansione

Simbolismo alternativo

Scansione dello ione precursore

Selezione m/z

Scansione

Scansione di perdita neutra

Scansionem/z = x

Scansionem/z = x-a

Monitoraggio di reazione selezionata

Selezione delframmentom/z = b

Selezione delprecursorem/z = a


Modalit di scansione ms ms1
Modalità di scansione MS/MS

  • Scansione dello ione prodotto: consiste nel selezionare uno ione precursore, di m/z fissato, e nella determinazione di tutti gli ioni prodotti dalla frammentazione attivata per collisione (CID).Se nella cella di collisione si usa un gas reagente, si osservano i prodotti di reazione attivate per collisione (CAR). Quando vengono prodotti solo ioni frammento, questa modalità di scansione è detta anche scansione di ioni frammento.

  • Scansione dello ione precursore: consiste nello scegliere uno ione prodotto e nel determinare gli ioni precursori. Permette di identificare gli ioni precursori di un certo frammento. Questa modalità di scansione, che non si può realizzare con la in time MS/MS, richiede la focalizzazione del secondo analizzatore su di uno ione selezionato, e la scansione di massa sul primo analizzatore. Vengono rivelati gli ioni precursori che per reazione o frammentazione producono ioni figlio della massa selezionata.


Modalit di scansione ms ms2
Modalità di scansione MS/MS

  • Scansione di perdita neutra (NLS): consiste nello scegliere un frammento neutro e nel rivelare tutte le frammentazioni che portano alla perdita di tale frammento. Come nel caso della scansione dello ione precursore, questa modalità non è realizzabile in MS/MS nel tempo. La scansione richiede che entrambi gli analizzatori scandiscano contemporaneamente, ma con una differenza di massa fissa a fra di loro. Quando uno ione di massa m attraversa il primo analizzatore, viene rivelato solo se produce un frammento di massa m – a.

  • Monitoraggio di reazioni selezionate (SRM): consiste nel selezionare una reazione di frammentazione. In questa modalità, entrambi gli analizzatori sono focalizzati su masse selezionate. Non si ha quindi scansione. È analogo al “monitoraggio di ioni selezionati” in spettrometria di massa singola, ma in questo caso gli ioni selezionati dal primo analizzatore danno un segnale solo se producono un certo frammento mediante una certa reazione. L’assenza di scansione permette di aumentare la sensibilità, oltre che la selettività.


Combinazioni strumentali per ms ms1
Combinazioni strumentali per MS/MS

  • MS/MS con risoluzione nello spazio

    • Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4).

    • Triplo quadrupolo: QqQ

    • Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF.

    • Combinati: EBqQ

    • QqTOF

  • MS/MS con risoluzione nel tempo (MSn)

    • Trappola ionica a quadrupolo (max MS8)

    • Risonanza ciclotronica (ICR FTMS)

    • Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo


Ms di molecole biologiche
MS di molecole biologiche

  • Classi di biomolecole

    • Proteine - Peptidi

    • Acidi nucleici

    • Polisaccaridi

    • Lipidi

  • Tecniche MS

    • Sorgenti: (FAB), MALDI, ESI

    • Analizzatori: TOF, quadrupolo (con ESI), FT ICR, ibridi

  • Tecniche separative

    • HPLC, SEC, CZE, elettroforesi su gel.


I progetti omici
I progetti -OMICI

  • Genoma

    • Identificare tutta la serie di ordini che il codice genetico può impartire ad una cellula, per comprendere e prevenire situazioni patologiche

  • Trascrittoma

    • Identificare e quantificare tutta la serie di ordini che il genoma impartisce effettivamente alla cellula, per comprendere ed eventualmente correggere le modalità di regolazione genica

  • Proteoma

    • Caratterizzare e quantificare il contenuto proteico di un sistema cellulare, mediante la determinazione di profili di espressione differenziati nel tempo e nello spazio, comprensivi delle informazioni sulle interazioni molecolari



Massa monoisotopica e massa chimica
Massa monoisotopica e massa chimica

Massa monoisotopica (picco 12C): 1085.55

Massa media (picco 12C): 1086.28

Per peptidi e proteine la differenza fra massa media (chimica) e massa mono-isotopica è circa 0.06%, distinguibile se lo spettrometro ha risoluzione pari a:

R = 100/0.06 = 1667 (nell’esempio sopra, R = 5000)


Identificazione del picco 12 c
Identificazione del picco 12C

Insulina

Albumina bovina

Per piccoli peptidi il primo picco, relativo alla massa monoisotopica, è anche quello più intenso. Questo non è vero per proteine di massa maggiore, in cui il picco 12C può essere poco intenso o addirittura non rivelabile. Oltre un certo valore di massa, il dato analitico utile è la massa media, che si ricava dal centroide del picco.


Risoluzione e sensibilit
Risoluzione e sensibilità

Quando non è possibile raggiungere risoluzione unitaria, ed identificare il picco di massa monoisotopica, è poco conveniente superare la risoluzione alla quale si può determinare la massa media con accuratezza. Questo è vero in particolare quando si deve raggiungere un compromesso fra risoluzione e sensibilità


Ruolo della ms in proteomica
Ruolo della MS in proteomica

  • Proteomica sistematica

    • Identificazione e sequenziamento di tutte le proteine contenute in una cellula. (MS o MS/MS accoppiata a 2D PAGE o 2D LC per l’analisi strutturale di miscele di peptidi e proteine intere)

  • Proteomica differenziale

    • Studio delle differenze rilevabili fra il proteoma di una cellula sana e quello di una cellula malata (2D PAGE + MS o MS/MS per la determinazione di mutazioni nella sequenza, modifiche post-traduzionali, modifiche conformazionali, sovra o sottoespressione)

  • Proteomica funzionale

    • Studio della funzione biologica delle proteine e delle loro interazioni con proteine e peptidi (Separazione in condizioni non denaturanti + MS di proteine e complessi proteici allo stato nativo)


Strategie proteomiche basate sulla ms
Strategie proteomiche basate sulla MS

Proteina (sconosciuta)

bottom-up

2D SDS PAGE

Top-down

digestione

Miscela di peptidi

Massa dei peptidi mediante

LC/LC/ESIMS

shotgun

Ricerca dei pesi molecolari

in banca dati

Massa di proteine intere mediante

(LC)ESI/MS

sconosciuta

nota

Sequenziamento in MSn

sconosciuta

MSn per ulteriori

Informazioni sulla

sequenza

nota

Identificazione e caratterizzazione di proteine

Ricerca dei pesi molecolari

in banca dati


Approccio proteomico top down
Approccio proteomico top-down

  • Si basa sulla determinazione della massa accurata (media) delle proteine in una matrice di complessità ridotta (ottenuta per purificazione con metodi biochimici o per separazione con tecniche non denaturanti)

  • Permette di determinare la conformazione delle proteine nel loro stato nativo, e le interazioni proteina-proteina (complessi proteici fra biomarker e proteine di trasporto, oligomeri funzionali)

  • Permette di determinare la composizione amminoacidica della proteina, ma non la loro sequenza

  • Non identifica la proteina in modo univoco in un proteoma complesso

  • Permette di studiare isoforme (mutazioni di singoli amminoacidi) e modificazioni post-traduzionali, ma non di localizzarle.


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Approccio proteomico top-down

Spettro m/z in ESI/qTOF di perossidasidi rafano (HRP) allo stato nativo

Il software dello spettrometro di massa identifica le famiglie di picchi negli spettri multicarica sovrapposti, ne determina il valore di m/z medio (il centroide del picco) e calcola lo spettro di massa ricostruito


Approccio proteomico top down1
Approccio proteomico top-down

F

43243.0

2Ca2+

2Ca2+

D

42422.0

E

43165.0

C

42343.1

2Ca2+

A

41521.9

B

41600.4

Glicosilazione

Glicosilazione

Sullo spettro di massa ricostruito si possono identificare isoforme, complessi metallo-proteina e modificazioni post-traduzionali


Lc ms ms per l identificazione de novo della sequenza peptidica
LC-MS/MS per l’identificazione “de novo” della sequenza peptidica

MS/MS

MS

y5

y9

y6

b8

b9

b11

y3

y7

y4

y10

b7

b3

b12

y2

m/z

200

600

1000

MS trace

MS/MS trace

30

40

50

Time [min]


Masse degli aminoacidi
Masse degli aminoacidi sequenza peptidica


Frammentazione dei peptidi
Frammentazione dei peptidi sequenza peptidica

x1

y1

z1

x2

y2

z2

x3

y3

z3

R4

R3

R2

R1

O

O

O

O

NH

CH-COH

C

NH

CH

C

NH

CH

C

H2N-CH

a1

b1

c1

a2

b2

c2

a3

b3

c3

R4

R3

+

R2

+

R1

O

O

O

O

NH

CH-COH

C

NH3

CH

C

NH

CH

C

H2N-CH

b2

y”2



Modifiche post traduzionali
Modifiche post-traduzionali sequenza peptidica

Glicosilazione Variabile (153.21->3000 Da)

Fosforilazione +79.98 Da

Acetilazione +42.04 Da

Formilazione +28.26 Da

Ossidazione +16.01 Da

Riduz. ponti disolfurici +2.02 Da

Ancora glicolipidica Variabile


Identificazione di siti modificati
Identificazione di siti modificati sequenza peptidica

Coincide con valore atteso?

Proteina sbagliata Mutazione

Modifica post-traduz.

No

Peptide Mapping

Peptide/i modificato/i

MS/MS

Identificazione Sito/i modificato/i

Peso Molecolare Proteina Intatta


Proteomica bottom up
Proteomica bottom-up sequenza peptidica

1000

1500

2000

Mass (m/z)

Elettroforesi bidimensionale

(2D PAGE)

estrazione dei peptidi

analisi MALDI/TOFMS

taglio degli spot;

digestione con tripsina

identificazione della proteina


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R-C sequenza peptidicaN-R’

Digestione enzimatica

proteina

legame peptidico

H

*alcuni enzimi proteolitici specifici sono:

tripsina tagli specifici solo a Lys-X o Arg-X

Lys-C Lys-X

Arg-C Arg-X

Glu-C (V-8) Glu-X and Asp-X

O

Enzima *

proteolitico

H2O

H

+

(frammenti proteolitici)

R-C-OH

H

N-R’

O


Identificazione di peptidi in banca dati
Identificazione di peptidi in banca dati sequenza peptidica

È la più comune procedura per l’identificazione dei peptidi mediante spettrometria di massa

La lista dei pesi molecolari ottenuta dall’analisi MALDI/TOFMS viene inserita in banca dati per l’identificazione della proteina incognita. Solitamente i segnali dei picchi a basso peso molecolare (< 500 Da) vengono esclusi dalla ricerca in quanto potrebbero essere segnali di matrice.


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Procedura di identificazione automatizzata sequenza peptidica

Digestione automatizzata: MALDI prep

Spot Cutter

2D GEL

MALDI/TOF MS

Risultati

elaborazione dei dati e ricerca in banca dati


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Vantaggi e limiti dell’elettroforesi sequenza peptidica

  • L’elettroforesi bidimensionale è oggi la più potente tecnica separativa utilizzata per le proteine, tuttavia essa presenta una serie di svantaggi:

  • E’ ristretta a proteine in un intervallo di masse molecolari tra 104e 106 Da

  • Non è possibile rivelare proteine poco espresse (bassa sensibilità)

  • Bassa riproducibilità da gel a gel

  • Lo spettrometro di massa non può essere interfacciato on-line con la tecnica separativa.


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1000 sequenza peptidica

1500

2000

Mass (m/z)

Cromatografia bidimensionale

Una alternativa alla 2D PAGE

In cromatografia multidimensionale due (o più) tecniche con proprietà “ortogonali” vengono combinate per migliorare la separazione

Separazioni cromatografiche

(*)

Analisi di massa

Raccolta difrazioni

(*)digestione proteolitica


Lc lc ms n per l analisi di miscele di peptidi
LC/LC MS sequenza peptidican per l’analisi di miscele di peptidi

frazione 1

frazione 2

minuti

prima dimensione: cromatografia

a scambio ionico

diverse frazioni di peptidi vengono

eluite effettuando un gradiente di

tampone salino a valori crescenti

di forza ionica.


Lc lc ms n per l analisi di miscele di peptidi1
LC/LC MS sequenza peptidican per l’analisi di miscele di peptidi

Seconda dimensione: cromatografia a fase inversa (C4 – C18)

Ciascuna frazione contenente i peptidi eluiti dalla colonna a scambio ionico viene ulteriormente separata su una colonna cromatografica a fase inversa e i singoli peptidi sono rivelati e identificati utilizzando uno spettrometro di massa ESI-Q/TOF in modalità MS/MS