PROTEIN–DNA RECOGNITION: READOUT MECHANISMS and VARIABILITY of DNA STRUCTURE МЕХАНИЗМЫ

1. PROTEIN–DNA RECOGNITION: READOUT MECHANISMS and VARIABILITY of DNA STRUCTURE МЕХАНИЗМЫ БЕЛКОВО–НУКЛЕИНОВОГО УЗНАВАНИЯ И КОНФОРМАЦИОННАЯДИНАМИКА ДНК A.Shestopalova O.Ya. Usikov Institute for Radiophysics and Electronics NAS of Ukraine, Kharkiv

2. 2 Белково-нуклеиновое узнавание Как белок правильно находит свое специфичное место связывания – «сайт узнавания» – из всех возможных, очень похожих последовательностей нуклеотидов (геном человека – более 3 миллиардов мономеров, или нуклеотидов)? Это проблема, которой занимаются молекулярные биологи, биохимики и биофизики все годы с момента открытия пространственной структуры ДНК – ее двойной спирали

3. 3 Aпрель,25, 1953 Tremendous things occur in biology. It seems to me, James Watson made discovery, comparable that made the Rutherford in 1911. Из письма Макса Дельбрюка Нильсу Бору от 14 апреля 1953 г.

4. 4 Международная программа «Геном человека»(HUGO) Установлена последовательность 3,3 млрд. нуклеотидов ДНК генома человека ENCODE – Encyclopedia of DNA Elements Энциклопедия элементов ДНК (ENCODE) – полный анализ функций некодирующей части генома человека

5. 5 Основные формы двойной спирали ДНК

6. 6 C3’-endo Конформациядезоксирибозы C3’-endo C2’-endo C2’-endo B-ДНК B/A A/B A-ДНК 3’ B-ДНКПромежуточные формы  A-ДНК 3’ 3’ C3’ C2’ C2’-endo C3’-endo C1’ C4’ South B-like puckers C2’-endo North A-like puckers C3’-endo O4’ 5’ m M m M 5’ 5’

7. 7 Конформациядвойной спирали Параметры динуклеотидного шага Параметры пары оснований

8. 8 Двухэтапный переход из В– в А–форму ДНК при изменении двух спиральных параметров – SlideиRoll А-форма В-форма Ǻ Ǻ В-форма промежуточная: альтернативная А-форма: смещение п.о. на 2 Ǻ (Slide); промежуточная форма: одновременное вращение п.о. на 12о (Roll) изменение Side и Roll

9. 9 малый Желобки ДНК Большой A-ДНК В-ДНК Желобкиширина: Б - 10.0Å; м - 16.2Å глубина: Б - 13.0 Å; м - 3.5Å Желобки ширина: Б - 17.0Å; м - 11.2Å глубина: Б - 8.5Å; м - 7.5Å м м Б Б

10. Конформациясахарофосфатного остова Углы α, β, γ, δ, ε, ζ, χ. 10 Переключение между g+ (гош+) и t (транс) конформациями угла  C5’ О5’ C5’ ВI↔ВII: углы ε,ζ АI↔АII:углыα, β, γ

11. 11 Белок связывается с одной или несколькими родственными последовательностями ДНК, проявляющими (по сравнению с другими последовательностями) наибольшее сродство к этому белку Сродство существование стерически и химически комплементарных поверхностей обеих молекул в сайтах связывания. В терминах термодинамики – это константа ассоциации Kas; в терминах кинетики – константа (скорость) диссоциацииKdis Специфичность селективное связывание белков на конкретных сайтахДНК, различие величин сродства между «своей» (cognate) последовательностью ДНК и другими (miscognate, noncognate) последовательностями. В терминах термодинамики – это разность между свободными энергиями G, (kcal/mol-1) связывания белков со «своей» и другими последовательностями ДНК

12. Стерическая и химическая комплементарность 12 Место связывания для Валина (Val) - cleft со стороны большого желобка 4 СН3-группы Тhy(black) - химическая комплементарность P22 c2 репрессор -ДНК cleft d(5’-ATTTAAGATATCTTAAAT-3′)2 Стерическая комплементарность Val 33 и валиновой «полости» Watkins D., Mohan S., Koudelka G. B., WilliamsL. D. // J. Mol. Biol. 2010, 396, 1145–1164

13. Схема связывания белков с ДНК (1) 13 Свободный белок Неспецифический комплекс Первый этап Образуется неспецифичный комплекс (электростатические взаимодействия) с последующими «слайдингом» молекулы белка вдоль цепи ДНК и узнавание «своей» последовательности. Kalodimos C. G., Biris N., Bonvin A. M., Levandoski M. M., Guennuegues M., Boelens R., Kaptein R. Structure and Flexibility Adaptation in Nonspecific and Specific Protein-DNA Complexes // SCIENCE. – 2004. - V. 305. – P.386-389.

14. 14 Схема связывания белков с ДНК (2) -спираль неупорядоченный Неспецифический комплекс ДНК:B-форма Специфический комплекс ДНК изогнута на 36° Второйэтап. Образованиеспецифичногокомплекса. Этапысопровождаютсяструктурнойадаптацией обеих молекул.

15. 15 Термодинамические параметры связывания белков с ДНК (свободная энергия, энтальпия, энтропия) Kas Специфичные: 1010 – 1012M–1, Неспецифичные: 104 M–1 и ниже G Специфичные: –16 –7 ккал/моль, Неспецифичные: –8 –5 ккал/моль Cp Специфичные: –1,1  –1,3 ккaл/моль.оK, Неспецифичные:  0

16. 16 Механизмы белково-нуклеинового узнавания Direct readout (прямое узнавание) Прямое узнавание, или прямое «считывание» оснований ДНК белками - «прямое» взаимодействие между парами оснований ДНК и аминокислотными остатками белков в сайте связывания (образование специфических водородных связей) Большой желобок Малый желобок Seeman N.C., et al.1976. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:804–808

17. 17 ДНК -LEF-1 (lymphoid enchancer factor-1) G T Специфические Н-связи междуаминокислотными остатками и основаниями, напр., Asn8 с TG динуклеотиднымшагом Asn8

18. 18 Механизмы белково-нуклеинового узнавания • Indirect Readout (Непрямое узнавание) • Белок: взаимодействие с неспецифическими группами оснований и сахарофосфатного остова • Узнавание обусловлено: • (1) уникальностью конформации определенного участка ДНК • (2) способностью к деформации определенного участка ДНК • Критерии узнавания: • изменения локальной геометрии пар оснований или остова; • изгибы или изломы фрагмента ДНК; • особенности рельефа и распределения • электростатического потенциала желобков; • упорядоченная гидратная оболочка. PurR-DNA • Возможности переходов и перестроек определяются: • преимуществом свободной энергии неканонической структуры над • канонической; • энергетическими затратами на перехода ДНК в неканоническую • конформацию. 434 Rep-DNA Все параметры сиквенс-специфичны

19. Структурные изменения ДНК в комплексе (изгиб двойной спирали) Minor groove Major groove 19 Локальные деформации: излом (кинк) Глобальные деформации: изгиб А-тракт Широкий малый желобок Идеальная А-ДНК Идеальная В-ДНК Узкий малый желобок Свободная ДНК ДНК в комплексе Rohs R., et al. (2010) Annu. Rev. Biochem., 79, 233–269

20. 20 Механизмы белково-нуклеинового узнавания Rohs R., et al. (2010) Annu. Rev. Biochem., 79, 233–269 • Нет простого «один-к-одному» кода узнавания между основаниями ДНК и белками • Деформации B-формы двойной спирали ДНК могут быть значительными и сиквенс-специфичными

21. 21 нормальная ширина нормальная ширина «Узнавание» малого желобка ДНК (размер и форма) Узкий малый желобок Fis–DNA crystalstructure Stella S et al. (2010)Genes Dev.

22. 22 Распределение электростатического потенциала ДНК Пары оснований Малый желобок Сахаро-фосфатный остов

23. 23 Малый желобок: размер и электростатический потенциал Rohs R et al. (2010) Annu. Rev. Biochem.

24. 24 Малый желобок: размер и электростатический потенциал в белково-нуклеиновых комплексах Rohs, R. et al. Nature 461, 1248–1253 (2009). Корреляции между шириной малого желобка и электростатическим потенциалом. Показано положение Аргининов в сайтах связывания (< 8.0 Å от оснований). A-трактыподчеркнуты зелеными линиями.

25. 25 Результаты Нуклеотиды с различными конформациями угла γ в свободной и связанной ДНК (в %) Сиквенс-специфичность переключений дезоксирибоз и/или угла γ в свободной и связанной ДНК Свободная ДНК ДНК в комплексах

26. 26 Результаты Большой желобок А-нуклеотиды В-нуклеотиды Полярно/гидрофобное отношение Малый желобок Полярно/гидрофобное отношение(из суммы ПДП полярных и неполярных атомов) в большом и малом желобках для A- и B-нуклеотидов с классическойg+и альтернативными g-,tконформациямиугла γ в связанной ДНК

27. 27 Комплекс рестрикционной нуклеазы EcoRV - ДНК(PDB ID:1SX5) Результаты • Фрагмент комплекса • EcoRV – ДНК: • желтый – ДНК, green – protein; K119-LYS, N120-ASN О3‘ - red (1),С5‘ -orange (2),О5‘ - green (3) (b) Последовательность дуплекса ДНК Конформация нуклеотида по углу P(A или B); конформация угла ; значения ASA атомовС5', О3',О5'в малом и большом желобках. X и Y: цепи ДНК: 5'- 3' и 3' - 5', соответственно.

28. 28 Результаты

29. 29 Результаты Электростатический потенциал пар нуклеотидов (kT/e) свободной В-ДНК gauche+γ angletransγ angle gauche-γ angle

30. «Узнавание» формы и электростатического потенциала малого желобка в нуклеосомах 30 Корреляция между шириной малого желобка нуклеосомы(PDB 1kx5) и распределением электростатического потенциала. Показано положение Аргининов в сайтах связывания. A-трактывыделены. Электростатический потенциал нуклеосомальной ДНК Rohs, R. et al. JBSD, 2010, 27(6), 861–866

31. Положения и сиквенс-специфичность переходов угла γв альтернативные конформациивнуклеосомах Результаты Нуклеотиды с альтернативными конформациями угла  trans gauche-

32. Результаты Положения нуклеотидов с альтернативными конформациями угла  внуклеосомах 1. Нуклеотиды с альтернативными конформациями угла γрасположены в основном на внешней поверхности нуклеосом 2. Равномерное распределение нуклеотидов с альтернативными конформациями угла γна внешней и внутренней поверхностях нуклеосом 1 2 1KX5 1M18 Нуклеотиды с альтернативными конформациями угла 

33. Результаты Изгиб в большой желобок Изгиб в малый желобок Положения нуклеотидов с альтернативными конформациями угла  внуклеосомах I цепь ДНК II цепь ДНК Number of nucleotide N, нуклеотиды

34. 34 Заключение Способность двойной спирали ДНК принимать альтернативные конформации - «внутреннее» свойство, присущее определенным последовательностям ДНК. Такие конформационные перестройки - проявление уникальных особенностей геометрии коротких фрагментов ДНК, динуклеотидных шагов и отдельных нуклеотидов. Они приводят к изменению формы и размеров желобков, нарушению стэкинга оснований, изменению площади доступной поверхности атомов. Эти перестройки могут быть структурными «сигналами» для узнавания белком конкретной последовательности ДНК.

35. 35 Заключение В результате конформационных перестроек меняются физические свойства, зависящие от структуры: полярно-неполярный профиль и электростатический потенциал малого и большого желобков. Сиквенс-специфичность таких изменений может способствовать реализации механизма непрямого узнавания белками своего сайта связыванияна ДНК

36. Благодарю за внимание!