Amplificação (clonagem) dos genes e seu armazenamento

1. Amplificação (clonagem) dos genes e seu armazenamento • Sistemas celulares-> bactérias, vírus, células eucarióticas; • Sistemas acelulares-> Reação em cadeia da polimerase (PCR)

2. Reação em cadeia da polimerase (PCR) • 1985- Kary Mullis inventou a reação em cadeia da polimerase (PCR) durante uma viagem de carro ao longo da costa da Califórnia. Sua ideia foi a concepção de uma técnica genial, relativamente simples, que funciona como complemento perfeito para a clonagem gênica. • Novas disciplinas surgiram como consequência direta da invenção da PCR-ecologia molecular, arqueologia biomolecular, ciência forense.

3. Reação em cadeia da polimerase (PCR)

4. Reação em cadeia da polimerase (PCR)

5. Bibliotecas Genômicas e de cDNA Departamento de Biologia Celular e Molecular

6. Bibliotecas • São coleções de sequencias de DNA usadas para armazenar informação-> coleção de genes recombinantes. • Ex. de usos: • isolamento de um gene específico; • sequenciamento; • clonagem; • identificação de genes em diferentes especies; • análise de proteínas relacionadas; • Etc...

7. Tipos de Bibliotecas: Biblioteca Genômica : uma coleção de clones de DNA representando o genoma de um organismo Biblioteca de cDNA : coleção de clones com insertos de DNA complementar (cDNA) sintetizada a partir de moleculas de mRNA de uma célula

8. Fontes de DNA para a Biblioteca • DNA Genomico: o DNA genômico é cortado e pequenospedaçossãoclonados. Vantagem:todo o genoma é cortado e clonadoempequenospedaços - pegatoda a sequencia. Desvantagem : vem um monte de lixo. Doismétodos: • 1. fragmentaçãorandômica do DNA empequenospedaçosquesãoligados a oligonucleotídeos, as pontascontêmsítios de restrição. • 2. Fragmentosparcialmentedigeridos com enzima de restrição. Podevariar o tempo de digestãoouquantidade de enzima. • cDNA: DNA sintetizado a partir do mRNA com a transcriptase reversa. Vantagem: somenteos genes expressossãoselecionados. Desvantagem: não é possivelselecionarsequencias de controleouíntrons e frequentementedependem do nível de expressãogênica.

10. Biblioteca genômicacomo fazer?

11. AcompanhamentodaReação: visualizaçãoemeletroforeseem gel de agarose • Variando o tempo de digestão ou quantidade de enzima

12. Biblioteca genômica

13. Biblioteca genômica

14. Biblioteca de cDNA

15. Biblioteca de cDNA Síntese de cDNA • oligo-dT anela na cauda poly-A. • Síntese da primeira fita de DNA a partir do mRNA em presença da transcriptase reversa

16. Síntese de cDNA • Remoção da fita original de RNA com: • Calor, alcali ou RNAse H. • Formação de grampo na extremidade 3’ e extensão do grampo com DNA polimerase • S1 nuclease (que corta bases não pareadas) • Ligação de linkers com DNA ligase e clonagem em um vetor.

17. Vetores de clonagem

18. Vetores • São usados para amplificar uma molécula de DNA . O DNA tem que ser inserido em um vetor de clonagem. • Um plasmídio tem uma origem de replicação e é capaz de replicar em bactérias. • Os vetores são geneticamente modificados gerando: - Plasmídeos; - Fagos; - Cosmídeos - BAC’s e - YAC’s

19. Vetoresparabibliotecas de DNA

20. Plasmideos • Plasmideos são circulares, dupla fita e encontrados em bactérias. • Podem replicar idependentemente podendo ter de poucas bases a 100 Kb. • Pode carrear fragmentos de até 10 kb • Plasmideos tem uma origem de replicação, marcador de seleção e sitios de restrição. • Após cultivo o clone pode ser recuperado facilmente após a lise das celulas e o fragmento de DNA ou mantido indefinitamente em glicerol a –70 0C.

21. Bibliotecagenômica: Bacteriofagoλ (Lambda) • Para clonar insertos de 10 a 20 Kb • Bibiotecas em plasmídeos comportam insertos de até 10 Kb

22. O genoma do Bacteriofagoλ

23. BibliotecaGenômica: Bacteriofagoλ

25. Biblioteca de Cosmideo Permite a clonagem de fragmentos de até 45 kb

26. BACs: Bacterial Artificial Chromosomes • Baseado no bacteriofago P1, o Plasmideo F e a região lacZ do plasmideo pUC • É um plasmideo com baixo número de cópias • Permite fragmentos de 50-300kb

27. YACs:Yeast Artificial Chromosomes Permite insertos de até 500 kbs YACs replicam como plasmideos em bacterias quando sem inserto de DNA. Assim que os fragmentos são inseridos, YACs são transferidos para células, e replicam como cromossomos eucarióticos

28. Triagem dos clonesde interesse

29. Triagem do Clone Recombinante Biblioteca de Bacteriofagos ou plasmideos Plaqueamento da Biblioteca Triagem por: • Sondagem por Hibridização • SondagemImunológica

30. Hibridização • O DNA em fita simples pode parear com outro DNA ou RNA desde que este possua região complementar. • Técnicas que aplicam a hibridização: • Southern blot: DNA digerido por enzima de restrição é separado em um e de eletroforese • Northern blot: usa RNA no gel ao invés do DNA • Hibridização in situ : usando um tecido • Hibridização de colonias : detecção de clones

31. Processo de hibridização • O DNA é aquecido a alta temperatura ou em presença de NaOH e desnatura. As fitas complementares a sonda anelam. Após lavagem somente as sondas ligadas ficam. • Estringência: Qual a necessidade de homologia perfeita para que as fitas se mantenham ligadas? DEPENDE DA ESTRINGENCIA Em BAIXA concentração de sal ALTA temperatura (Depende da quantidade de GC) MAIOR a necessidade de complementariedade. • Autorradiografia. Sonda marcada impressiona o filme de raioX.

32. Processo de hibridização

33. Processo de hibridização

34. Hibridização com sonda radioativa

35. Hibridização com sonda não radioativa

36. Hibridização com sonda não radioativa

38. Sondagemimunológica

39. Sondagemimunológica

40. Southern hybridization (DNA)

43. TriandoumaBiblioteca: Hibridização de colônias

45. Hibridização de Colônias

46. A sonda pode ser sintetizada?

47. Triagem de bibliotecaGenômica: II.ColôniaImunoensaio A sonda é um anticorpo, as colônias são crescidas e a proteína recombinante é expressa

48. TriandoumaBibliotecaGenômica: II.ColôniaImunoensaio A quimioluminescencia também irá impressionar o filme de raio-X

49. BibliotecaGenomica: Bacteriofagoλ

50. Plaques - Bacteriofagoλ