Dr hab. n. med. Sylwia Kwiatkowska Klinika Gruźlicy i Chorób Płuc

1. Dr hab. n. med. Sylwia Kwiatkowska Klinika Gruźlicy i Chorób Płuc Bakteriologia gruźlicy Łódź 2003

2. Klasyfikacja prątków Klasa - Schizomycetes Rząd - Actiomycetales Rodzina - Mycobacteriacae Rodzaj - Mycobacterium

3. Mycobacterium tubeculosis complex M. tuberculosis M. bovis M. microti M. africanum M. canettii atenuowana formaM. bovis BCG

4. Podział prątków atypowychwg Runyona

5. Materiały, w których poszukujemy prątkówu chorych na gruźlicę płuc Plwocina spontaniczna Popłuczyny żołądkowe Plwocina indukowana Popłuczyny krtaniowe Specimeny bronchoskopowe Bronchoaspiratmateriał z cewnikowaniamateriał ze szczoteczkowaniaBALF

6. Metody wykrywania prątków 1. Bakterioskopia Met. Ziehl-Neelsena Met. fluorescencyjna - auramina - rodamina - oranż akrydyny Wynik + - pojedyncze prątki w preparacie ++ - pojedyncze prątki w poszczególnych polach widzenia +++ - liczne prątki w poszczególnych p.w.

7. Bakterioskopia Met. Bakterioskopii – szybka, tania, o niskiej czułości i swoistości Nie odróżnia prątków gruźlicy od prątków atypowych, w tym saprofitycznych

8. 2. Metoda hodowli Złoty standard w diagnostyce bakteriologicznej gruźlicy Czułość 80-85% - wykrywa 10 prątków w 1 ml badanego materiału Swoistość 98-100% Uzyskany tą metodą wzrost prątków umożliwia ich dokładną identyfikację Wyhodowanie prątków umożliwia przeprowadzenie testów lekowrażliwości Uzyskanie hodowli prątków umożliwia za pomocą metod genetycznych prześledzenie łańcucha epidemiologicznego

9. Metoda hodowli Najczęściej używane podłoże to podłoże Lowensteina-Jensena Prątki rosną wolno 3-8 tygodni Ocena nasilenia prątkowania (+) - do 20 kolonii, wynik podawany jest liczbą + - liczba kol. 20-100 ++ - 100-200, wzrost policzalny+++ - powyżej 200 kol., wzrost zlewny, niepoliczalny

10. Metoda hodowli Prątki widoczne nierosnące – bacillus visibles non viables Są widoczne w badaniu mikroskopowym, ale nie rosną na odpowiednich podłożach Ich obecność łączy się ze skuteczną terapią Liczba ich wzrosła po wprowadzeniu rifampicyny

11. Hodowla prątków w systemie Bactec 460

12. Metoda Bactec 460 Metoda jest szczególnie użyteczna w wykrywaniu prątków w materiałach skąpoprątkowych: • płyn opłucnowy • płyn mózgowo-rdzeniowy • plwocina od chorych ze zmianami minimalnymi w płucach Wzrost prątków występuje pod koniec pierwszego tygodnia, test lekowrażliwości trwa następny tydzień (dotyczy leków pierwszej linii terapii)

13. Metoda MB/BacT Prątki rosną na podłożu Middlebrooka 7H9, a wytwarzany dwutlenek węgla powoduje zmianę zabarwienia sensora umieszczonego w dnie butelki z zielonej na żółtą Sygnał detekcyjny w sposób ciągły przekazywany jest do komputera, który rejestruje intensywność wzrostu prątków

14. MB/BacT Bactec 460 L-J Mycobacterium tuberculosis complex 84,5 91,2 70,9 Odsetek dodatnich wyników w różnych metodach hodowli

15. Metody serologiczne Odpowiedź humoralna w gruźlicy nie ma charakteru ochronnego. Odpowiedź humoralna rośnie wraz ze wzrostem zaawansowania zmian. Badania serologiczne istotne w gruźlicy wieku dziecięcego oraz pozapłucnej. Stosowana jest metoda ELISA oceniająca obecność przeciwciał w stosunku do antygenu 38kDa i A60. Czułość tej metody 30-70% (w płynie opłucnowym 50%)

16. Metody genetyczne 1. Sonda genetyczna Oparta jest na zjawisku hybrydyzacji pojedynczej nici kwasów nukleinowych z komplementarnym łańcuchem polinukleotydowym. Sondy mogą być różnej długości, znakowane są izotopami i wykrywane przy pomocy licznika scyntylacyjnego, lub fosfatazą alkaliczną i wykrywany w reakcjach barwnych, lub za pomocą fluorescencji (oranż akrydyny).

17. Metody genetyczne 2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) PCR polega na wielokrotnej amplifikacji wybranych odcinków genomu prątka Warunkiem jej przeprowadzenia jest znajomość sekwencji nukleotydowej otaczającej powielany fragment tak, aby można uzyskać jego komplementarny odcinek – tzw. „starter” (primer). Najczęściej powielanym fragmentem genomu prątka jest sekwencja insercyjna IS 6110, a w następnej kolejności IS 986, gen kodujący HSP 65 kDa

18. Metody genetyczne Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) denaturacja w temp 95oC 1-3 min z uzyskaniem pojedynczej nici DNA dołączenie w temp 50-72oC starterów (0,5 – 3 min) synteza DNA przy pomocy termostabilnej polimerazy Taq w temp 72oC (0,5 – 3 min) Liczba cykli 30-40. Zamplifikowanyprodukt wykrywa się przy pomocy znakowanych sond.

19. Przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy

20. Metody genetyczne 3. Reakcja łańcuchowa ligazy Również swoista dla M. tuberculosis complex. Amplifikuje się sekwencją kwasu nukleinowego kodującą antygen b (PAB). Dwie pary oligonukleotydowych znakowannych sond hybrydyzują z komplementarną nicią DNA. Termostabilna polimeraza wypełnia brakujący odcinek pojedynczej nici DNA.

21. Metody genetyczne Ligaza kowalencyjnie łączy dwie sąsiadujące sondy. Zamplifikowany produkt absorbowany jest na mikrocząsteczkach. Detekcja odbywa się w oparciu o reakcję fluorescencji w specjalnym analizatorze.

22. Reakcja łańcuchowa ligazy

23. Metody genetyczne Reakcja łańcuchowa polimerazy i ligazy Wykrywa prątki M. tuberculosis complex żywe i martwe. Średnia czułość 70-100%. W materiałach skąpoprątkowych waha się pomiędzy 46 a 70%. Dolna granica wykrywalności 10 prątków w badanym materiale.

24. Metody genetyczne 4. Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) Identyfikuje poszczególne szczepy prątków, wykorzystywana zwłaszcza w badaniach epidemiologicznych. Ocenia ona ilość oraz umiejscowienie w genomie prątka sekwencji insercyjnej IS 6110 (1355 par zasad).

25. Metody genetyczne Etapy RFLP • ekstrahowanie DNA z komórek prątków • poddanie go działaniu enzymów restrykcyjnych • rozdzielenie fragmentów restrykcyjnych na żelu agarozowym • przeniesienie rozdzielonego materiału na nylonowe membrany • hybrydyzacja ze znakowanymi sondami komplementarnymi do 245 par zasad fragmentu IS 6110 • odczyt komputerowy – układ i ilość linii • odpowiada wielkości poszczególnych fragmentów.

26. Metody genetyczne Warunkiem zastosowania w badaniach epidemiologicznych określonego markera genetycznego (np. IS 6110) jest - z jednej strony - jego zmienność, występująca wystarczająco szybko, aby szczepy niezwiązane łańcuchem epidemiologicznym były różne. Natomiast - z drugiej strony – powinien on być na tyle stały, aby szczepy połączone ze sobą były identyczne. Okres półtrwania dla IS 6110 wynosi 3-4 lata i wydaje się spełniać te wymogi.

27. Wynik metody RFLP

28. Am. J. Respir. Crit. Care Med.. 1994 r. Gran Canaria 1991-1996 rok 960 chorych Wsk. zap. 30 18 chorych 2× zachorowałow okresie co najmniej 12 m-cy 56% Reactivatio endogenes nie zakończyli leczenia opornośc na leki 44% Reinfectio egzogenes zakończyli prawidłowo leczenie

29. Metody chromatogaficzne Chromatografia płynna wysokociśnieniowaHPLC (High Preassure Liquid Chromatography) Liczba i rodzaj kwasów mykolowych są charakterystyczne dla każdego gatunku. Rozdział wyekstrahowanych kwasów mykolowych na specjalnych kolumnach a uzyskane wzory elucyjne są swoiste dla danego gatunku prątka

30. lekooporność pierwotna wtórna New York N Engl. J. Med. 1999 r. 1987-1991 rok 17 chorych HIV+ prątkujących w posiewie co najmniej 1 rok I grupa (ten sam szczep) zachowana wrażliwość na leki p. prątkowe (ten sam szczep) lekooporność pierwotna i wtórna 4 chorychI-szy szczep – zachowana wrażliwość na lekiII nowy szczep wielolekooporny (lekooporność pierwotna wtórnie nabyta)

31. Lekowrażliwość prątków • W Polsce badanie lekowrażliwości przeprowadza się: • Metodą wskaźnika RR (Resistance Ratio) = minimalne stężenie leku hamujące wzrost szczepu badanego / minimalne stężenie leku hamujące wzrost szczepu H37RvRR > 4 dla hydrazydu i strepromycynyRR > 8 dla PAS • Metodą proporcji z oceną krytycznego odsetka oporności szczepy oporne