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Identification de la mutation Jak2V617F dans les syndromes myeloprolif é ratifs. F.harieche, N.Abdennebi, F.Boukhemia, F.Zerhouni, R.M.Hamladji. Syndromes myeloprolifératifs. Similitudes cliniques et biologiques Origine commune: CSH hyperplasie myéloïde globale
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Identification de la mutation Jak2V617F dans les syndromes myeloprolifératifs F.harieche, N.Abdennebi, F.Boukhemia, F.Zerhouni, R.M.Hamladji.
Syndromes myeloprolifératifs • Similitudes cliniques et biologiques • Origine commune: CSH • hyperplasie myéloïde globale • hypersensibilité voire indépendance des progéniteurs hématopoeitiques aux facteurs de croissance. • Classification OMS: semi moléculaire • SMP atypiques • leucémie neutrophile chroniq • mastocytose systémique • leucémie éosinophile chroniq • SHE • SMP classiques: • SMP BCR-ABL+: LMC • SMP BCR-ABL neg: • P.V, TE, MFP Jak2 V617F
Jak2: famille Janus kinases (Jak1,Jak2,jak3,Tyk2) TK associée R-EPO, MPL, R-G-CSF Fonction: régulation de l`expression des gènes en réponse aux cytokines. Mutation Jak2V617F…? Jak-STAT migration vers le noyau CASCADE DE SIGNAUX DE PROLIFERATION:
Gène cloné 1989: 9p24 Mutation JH2 Substitution G……T nt 1849 Changement Val…..Phe au codon 617 Jak2 V617F Mutation acquise, unique,clonale CSH: cellules myéloïdes (PN, EB, pqt) Absente des Ly T Jak2 muté: pas d`inhibition par le domaine JH2 activité kinase constitutivement active, indépendante de la fixation du ligand sur son récepteur….activation signaux en aval. KB Structure des tyrosine kinases Jak FERM SH2 JH1 JH2 R-EPO interacting domain YY Src homology 2 domaine pseudo Kinase domaine Kinase Mutation Jak2V617F
Jak2 et oncogenèse • Protéines de fusion: SMP atypiques : • t(8;9)(p21;p24) PCM1-JAK2 • t(9;12)(p24;p13) JAK2-ETV6 • t(9;22)(p24;q11.2) JAK2-BCR • Perte du domaine de fixation aux récepteurs de cytokines (FERM) • pas de gain de fonction !!!
Fréquence de la mutation JAK2 • Différences de fréquences: • Stringence des critères de diagnostic de PV, • La sensibilité des méthodes de détection de la mutation, • La source de l`ADN (PN..!!!)
Patients (n=59) • Fev 2010 – mars 2011. • 22 (37%) Patients traités HU; …….. BCR-ABL neg.
Échantillons biologiques • Sang total: EDTA 0.34M • PN+++: Ficoll+lyse totale GR • 3 étapes: • Extraction d`ADN (QiagenTM)…..10ng/ul • Amplification: PCR: Seeplex Jak2 genotyping Kit. « primers DPO » - Gène sauvage (WT) - Gène muté 35 cycles • Visualisation des produits de PCR (E-se gel d`agarose à 2% +BET)…..UV 800pb (contrôle int) 600pb (non muté) 300pb (muté)
Résultats • Mutations à l`état hétérozygote: • 2 situations: Allèle muté +allèle WT PN malins PN normaux
Commentaires 3 implications: • Affirmer le diagnostic de SMP au même titre que BCR-ABL, 1er examen à effectuer devant: • Polyglobulie, .évaluation initiale + EPO sérique. (critère majeur) • Thrombocytose, • Hyperleucocytose d`étiologie non évidente. • Budd-Chiari (thromboses révélatrices de SMP) • Rapport Jak2V817F/Jak2WT dans les PN: élément pronostique évolution vers myelofibrose TE,PV • Développer thérapeutiques de type ITK: ciblées Jak2 muté.
PCR • Spécifique, sensible • Reproductible • Multiplex: coamplification des 2 allèles Jak2 (sauvage et muté) ………… 1 seule étape • Rapide: 1 jour (5 heures). • Contrôle interne d`amplification (intégrité ADN: reprentativité) • Marqueur de taille intégré. Mais: • Faux négatifs: • Coexistance de PN issus de CSH non mutée et PN issus de CSH mutée. • Nature du matériel cellulaire testé (lyse cellulaire) • traitements antérieurs: diminution de la charge de l`allèle muté.