第十四章真菌毒素的测定

第十四章真菌毒素的测定

概述第一节食品中黄曲霉素B1的测定第二节食品中

讨论主题 一、概述二、测定方法

第一个主题 1、黄曲霉素简介 2、黄曲霉素的性质 3、黄曲霉素的毒性及卫生标准 4、黄曲霉素对粮油的污染状况

第二个主题 1、原理 2、试剂 3、操作方法 4、计算

第一节食品中黄曲霉素B1的测定 一、概述 1、黄曲霉素简介黄曲霉毒素(Aflatoxin , 简称AFT)是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，它不是单一的产物，是一类结构相似的化合物（二呋喃氧杂萘邻酮的衍生物），用色谱分析方法从毒素中可分离出20多种荧光物质，根据紫外线照射下所显的颜色分为: B群，显蓝紫色荧光；G群，显黄绿色荧光，两大类。到目前为止已鉴定出来12种异构体，即AFT B1、B2、G1、 G2、M1、M2、B2a、G2a、P1、GM1、黄曲霉素醇，四氢脱氧黄曲霉素B1等，其化学结构见图1，图2。 ▽

由图可以看出，分在AFT B1及G1的2，3位置环上加一对氢原子，则产生相应的还原原产物—B2及G2；在环的4位置羟化，则产生相应的产物M1，GM1；B1分子上的甲氧基脱甲基则产生相应的P1；M1是4–OH毒素B1；M2是4 –OH基荧曲霉素B2；B2a是M2的异构体；G2a是GM1的异构体。 ▽

2、黄曲霉的性质 AFT性质非常稳定，在近300℃的温度下也难分解，只有在强酸、强碱和强氧化剂的条件下才被分解，能溶于乙腈、苯、三氯甲烷、甲醇、乙醇等溶剂中，但不溶于已烷、石油醚和乙醚中，在水中溶解度也很低。在紫外线照射下有很强的荧光。 ▽

3、黄曲霉素的毒性与卫生标准 AFT是目前已知的强致癌物之一，属于肝脏毒素。各种AFT的毒性有很大的差别，按鸭雏口服的LD50(mg/kg)排列如下： B1 > G1 > B2 > M1 > G2 > M2 > B2a > G2a 0.36 0.78 1.7 3.2 3.5 12 240 320 在毒理学上认为LD50<50即为剧毒，而AFTB1大大低于这个标准，因此AFTB1是超剧毒物质，由于它在AFT中毒性最大，在食品中分布又最广；因此，国际和国内的食品卫生标准中作出了严格的规定，是许多食品必须检测的指标,见表1、表2。黄曲霉素的毒性、致癌性和致癌突变性与AFTB1、G1、M1 的二呋喃环末端的双键的环氧化代谢产物— 2，3—环氧化物有关，而无此双键，同毒性较低（图3） ▽

图3 AFTB1代谢的环氧化物渗入DNA、RNA和蛋白质，改变了 DNA的模板性质，也可能是直接影响有关酶，抑制核酸的合成，损害肝脏。

4、黄曲霉毒素对粮油的污染状况 AFT对粮油的污染是相当广泛的,在稻谷、小麦、玉米、花生、大米和花生油中都发现有 AFTB1的污染。其中污染最严重的是花生、玉米和棉籽，高梁及稻谷次之，麦类则轻微得多，这种不平衡的分布是与各种作物的生物学特性和化学组成以及成熟所处的气候条件有很大的关系。一般说来富含脂肪的花生、棉籽较易产生AFTB1（大豆例外）。收获季节如高温、高湿，也易造成AFTB1的污染。还应指出的是AFTB1污染是不均匀的，如小麦籽粒中大部分分布在麸皮中，玉米则污染整个籽粒；花生、棉籽则集中少数籽粒中，例如一批含AFTB1 8000PPb 的棉籽样品中，随机取样150粒，其中只有18粒带毒，其中1粒含量达800000PPb。因此，测定的样品中一个霉变粒或一个霉变部位 AFTB1含量往往会影响检验的结果，针对这一问题测定AFTB1时扦取的样品具有代表性是非常重要的，为此，必须严格遵循扦样、分样、制备试样的操作规程；扦取的样品要达到一定数量（5kg），每批样品采取3份，小样（0.5∽1kg）全部粉碎通过一定孔径的筛　　　　　 ▽

（粮食20目筛，花生10目筛）；对于明显的霉变粮粒或霉变部位应单独取样扦验。只有这样才能保证检验的准确性。　　　　　　　　　▽（粮食20目筛，花生10目筛）；对于明显的霉变粮粒或霉变部位应单独取样扦验。只有这样才能保证检验的准确性。　　　　　　　　　▽

二测定方法 （一）原理　　根据AFTB1的溶解特性，用适当的溶剂对样品中AFTB1 进行提取、净化，然后经浓缩、薄层层析分离后，在波长 365nm紫外线照射下，可产生蓝紫色荧光，根据产生的荧光的颜色和荧光强度进行定性和定量分析。　

（二）试剂 　　在此不具体介绍所用的试剂，但是应当指出的是，我们所测定的物质是痕迹量的PPb级，而且是剧毒的，因此所用试剂必须注意三点： 1、所有溶剂在实验前先要进行一次空白试验，如不干扰测定，即可使用，否则需逐一检查，重蒸后方可使用。 2、AFTB1标准溶液浓度应调到恰为10μg/ml。 3、消毒液—次氯酸钠溶液（市售名安替福民为5%次氯　　　酸钠溶液）。　　　　（1）仪器消毒　使用后的玻璃仪器用1%NaCLO溶液浸泡　　　半天或5%溶液浸泡片刻，即可达到去毒效果，避免　污染环境。　　（2）实验人员可用脱脂棉蘸少许溶液擦洗双手。

（三）操作方法 操作步骤：　　　　扦样、分样、制样→提取→净化→浓缩→薄层层析　　　　→定性→确证→定量 1、取样 2、提取　　（1）玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。　　　①20.0g粉碎试样置于具塞锥形瓶中，加30ml正已烷或石油醚和100ml甲醇水溶液，振荡提取，静置，过滤滤于分液漏斗中，静置分层，放出甲醇水溶液于另一个分液漏斗中，取20.0ml甲醇水溶液（相当4g样品），置于另一分液漏斗中，加20.0ml三氯甲烷，再加少许氯化钠，振摇。静置分层，放出三氯甲烷层经盛有三氯甲烷湿润的10g无水硫酸钠漏斗，滤于蒸发皿。▽

并用少量三氯甲烷洗滤器，洗液并于蒸发皿中，在通风柜内于并用少量三氯甲烷洗滤器，洗液并于蒸发皿中，在通风柜内于 65℃水浴上将蒸发皿内溶液挥干，然后放在冰盒上冷却，准确加入1.0ml苯－乙腈混合液溶解残渣，将溶液移入2ml具塞试管中（为每毫长含4g样品的提取液）。 ②花生油等提取（略） 3、薄层层析（1）点样　在距薄层板下端的3cm基线上用微量注射器滴加样液，标液，一块板滴加4 个点，点的直径～3mm，大小一致，在一条直线上，点间距离～1mm。滴加样式如下：　　　　　第一点　　第二点　　第三点　　第四点样液—20 2020 μl 淡标(0.04 μg/ml)10 — 10 — μl 浓标(0.2 μg/ml) ———10 μl （最低荧光点）（样点）（荧光定位） ▽

（2）展开 　①预展　在展开槽内加10ml无水乙醚，预展，12cm，将脂肪、色素等杂质移走。　②展开　将预展后的薄层板放至另一加有10ml丙酮–三氯甲烷（8:92）展开液的展开槽中，展开10～12cm，将AFTB1移动到一定的比移值位置。（3）观察　将薄层板置于365nm的紫外灯下观察，观察结果有如下情况：　①若第二点在与AFTB1标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，则样品检出为阴性（含量低于5μg／kg）。　②若第二点在相应的位置上有蓝色荧光点，则需进一步确证。（4）确证试验　为了证实样点上蓝紫色荧光确系由AFTB1的衍生物（ AFTB2a即2－羟基黄曲霉素B2）。具体操作如下： ▽

　　　　　　　第一点　第二点　第三点　第四点样液 — 20 — 20 μl 淡标（0.04 μg/ml） 10 10 10 —μl 三氟乙酸 1小滴　　１小滴　　　——μl 　　　　　　　　　（反应5min ，热风吹2min ，<40℃）展开：同上操作；观察：由于反应只有AFTB1发生，衍生物分子量加大，移动速　　率减慢，比移值减小。（5）定量 ①如样点的荧光强度与淡标点的荧光强度一致，则样品中AFTB1含量为5 μg/kg ; ②如样点的荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升，直至样点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致。　　　▽

（四）计算 计算公式为： V1 ×D 1000 X=0.0004×———— ×———— V2 m 式中：X—样品中AFTB1的含量， μg/kg ； V1—加入苯—乙腈混合液体积，ml ; V2—出现最低荧光点时滴加样液的体积，ml； D—样液的稀释倍数； m—加入苯—乙腈混合液溶解时相当样品的质量g ； 0.0004—AFTB1最低检出量， μg。 ▽

例如：已知定容时加到蒸发皿中苯—乙腈溶液为1ml（V1）；样液稀释1倍，再加1ml苯—乙腈溶液（D）；出现最低荧光点时液样体积为0.02ml（V2）；加入苯—乙腈混合液溶解时相当样品的质量4g（m），则该样品AFTB1含量为：例如：已知定容时加到蒸发皿中苯—乙腈溶液为1ml（V1）；样液稀释1倍，再加1ml苯—乙腈溶液（D）；出现最低荧光点时液样体积为0.02ml（V2）；加入苯—乙腈混合液溶解时相当样品的质量4g（m），则该样品AFTB1含量为： 1×2 1000 X=0.0004×———— ×———— =12 μg/kg • 0.02 4 ▽

第十四章真菌毒素的测定