G énmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák

1. Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: deléció izolálása P elem remobilizációval

2. Bevezetés: • P elem: mozgó genetikai elem- ugrásához transzpozáz szükéges • Vad típusú P elem Laborban használt P elem • P elem mobilizációhoz szükséges: mutátor elem transzpozáz elem • Inszerció - nem mindig génbe inszertálódik - lehet a vizsgált gén közelében • Remobilizáció lehet - precíz - nem precíz: inszerció, deléció • Deléciós mutánsok izolálása

3. P elem vizsgált gén szomszéd gén Deléció előállítása P elem remobilizációval transzpozáz

4. PCR primer P elem vizsgált gén deléció PCR primer Deléciós mutánsok azonosítása • Fenotípus alapján: létfontosságú génben történt deléció letalitást okoz • PCR-al: megfelelő primerekkel a kapott deléció mérete meghatározható

5. Deléció létrehozása egy X kromoszómás génben 1. Jumpstarter hímek előállítása: w, P(w+) / w, P(w+) ♀ ♀X+/Y; Df(3L)C4/TM3, Sb P(Δ2-3) ♂♂ A legyek szeme piros a w+ miatt Sb: rövid szőr fenotípus Utódok: w, P(w+)/Y; +/ TM3, SbP(Δ2-3)♂ Jumpstarter hímek: piros szem, rövid szőr Jumpstarterek ivarsejtjeiben játszódik le aP elemmobilizációja.

6. X w, P(w+)/Y; +/ TM3, SbP(Δ2-3)♂ Df(1)6C, w/FM6, w; +/+ ♀ ♀ 2. P elem-hiányos kromoszómák azonosítása balanszer kr-t hordozó nőstény jumpstarter hím FM6: első kromoszómás balanszer , Bar domináns mutációt hordozza w, ΔP/FM6, w; +/+ ♀ G1 utódok: fehér és Bar szemű, valamint hosszú szőrű ΔP ΔP jelöli a P elem hiányt A w, ΔP/FM6 genotípusú G1 utódok egy-egy olyan kromoszómát hordoznak, amelyből a P elem kiugrott. Ezt úgy is mondhatjuk, hogy a G1 utódok egy-egy „mutagenizált” kromoszómát reprezentálnak. A P elem kiugrása lehet pontos, vagy pontatlan.

7. 3.lépés: törzsalapítás w, ΔP/FM6, w ♀ FM6, w/Y ♂ ♂ X w, ΔP/Y ♂ w, ΔP/FM6, w ♀ X FM6, w/Y ♂ FM6, w/FM6, w ♀ törzsfenntartás • A törzsalapító keresztezéseket a nem balanszeres w, ΔP/ Yhímek megjelenésére, vagy hiányára teszteljük. • A w, ΔP/ Yhímek hiánya azt mutatja hogy a w, ΔP kromoszómán letális mutáció képződött. • A keresztezésből származó fertilis utódok átrázásával fenntartható az új mutációt hordozó törzs.

8. Vad típusú PCR termék mutáns PCR termék A deléció kimutatása és méretének meghatározása A kapott mutáns törzsekből genomikus DNS-t kell izolálni, majd megfelelő primerek segítségével a deléció mérete meghatározható. P elem vad típus mutáns Vizsgált gén Deléció képződése esetén: A deléciók mérete néhány bázispártól citológiailag látható nagyságig terjedhet.

9. Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: deléció izolálása hímrekombinációval

10. Bevezetés: • A P elem mobilizációja crossing overt okoz Drosophila ivar- és szomatikus sejtekben is, ahol rekombináció normálisan nem történik. • A P elem indukált rekombinációt tanulmányozták osztódó ivarsejtekben a rekombináns kromoszómák struktúrájának vizsgálatával. • Korábbi tanulmányok szerint a legtöbb P elem indukált hímrekombinációs esemény az inszercióval szomszédos szekvenciák delécóját vagy duplikációját váltja ki.

11. Három modell a P elem indukálta rekombinációs folyamatok magyarázatára • A P elem transzpozáz random vág a genomban, ahol a transzpozáz expresszálódik. Ezek rekombináns helyeket produkálnak. • A hímrekobináció egy mellékterméke azoknak a kettősszálú töréseket javító mechanizmusoknak, amelyek a P elem kivágódása után következnek be. • A P elem egy másik DNS duplexen elhelyezkedő P elemmel transzpozáz bekötődésével „hibrid elemet” alkot a sister kromatidákon.

12. P elem C D A B Első lépésben a P elem jobb végéhez és a sister kromatidán lévő P elem bal végéhez transzpozáz kapcsolódik „hibrid elemet” formálva. C D A B A B C D A B C D Midkét végen duplaszálú törés következik be. A P elemek szabad végei target helyhez tapadnak, amivel rekombinációs mechanizmust indukálnak A B C D A B C D C D A B C D A B A B D A P elemet hordozó kromatidák rekombinánsok. A duplaszálú törések kijavításával a kromoszóma funkcionális lesz, de valószínűleg nem rekombináns. C D A B C D C A B A B C D

13. Hímrekombináció során a P elem mindkét oldalán képződik deléció, vagy duplikáció P elem A B C D A B C D független rekombinánsok száma A B D C C D A B B A B C D C D A

14. A hímrekombináció egy hőmérsékletfüggő folyamat

15. P-elem 3 kb P-elem Rekombinánsok vizsgálata: PCR-elDNS szekvenálássalKomplementációs teszttelA kromoszómák citólógiai vizsgálatával Mutáns jelöltek A B C D Ms 5 kb 3 kb 1 kb 0,5 kb

16. A deléciók mérete A deléciók mérete néhány bázispártól néhány száz kb.-ig terjedhet. A nagyobb deléciókat nem lehet PCR amplifikációval kimutatni. A nagyobb deléciók méretét komplementációs teszttel, és nyálmirígy óriáskromoszóma preparátumok citológiai analízisével határozzák meg. Az ábrán egy hímrekombinációval indukált deléció látható, amelynek mérete az 50C20-23 régiótól az 50D4-7 régióig terjed.

17. P elem Vizsgált gén Szomszéd gén DELÉCIÓ Mikor alkalmazzunk hímrekombinációt? • A vizsgálni kívánt gén közelében van P elem inszerció. • Túl nagy génsűrűség esetén, amikor a P elem remobilizációval indukált deléció érintheti a szomszédos géneket.

18. P(w+) Kísérlet deléciós mutánsok izolálásárahímrekombinációval w- mutátor törzs w- P(w+) w- m transzpozáz forrás w- m CyO,P(Δ2-3) w- m marker mutációt hordozó törzs m Y

19. P(w+) P(w+) marker A rekombináns kromoszómákat a P elem és egy marker mutáció szegregációjának változása alapján lehet azonosítani + gén gén marker gén

20. P(w+) P(w+) P(w+) P(w+) w- w- m X w- m Y CyO,P(Δ2-3) P(w+) mutátor törzs w- w- m X m w- Y m CyO,P(Δ2-3) „jumpstarter” hím w- w- m m w- m m Y

21. P(w+) P(w+) P(w+) P(w+) P(w+) Törzsalapítás w- m w- Tm3, Sb, Ser m w- X / w- Tm6,Tb, Hu w- m m Y w- m / w- m P(w+) Homozigóta életképes w- m X Y Tm6,Tb, Hu w- m / A rekombináns kromoszómák fenntarthatók a balanszerrel szemben. Y Tm6,Tb, Hu Homozigóta letális

22. Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: transzgénikus állatok előállítása

23. EcoRI, KpnI, BamHI, XbaI, HpaI, XhoI, PstI klónozó hely bakteriális szekvencia white 5’-vég Hsp70 3’-vég Transzgénikus legyek előállítása P elem mikrionjektálással A kívánt DNS szakasz vagy szakaszok P elem végek közé vannak helyezve egy plazmidban amit transzpozáz jelenlétében injektálnak M citotípusú pre-blasztoderma állapotban lévő embriókba. Transzpozáz forrás biztosítása: - tisztított transzpozáz fehérje a plazmidhoz kötve - „helper” plazmiddal történő együttes injektálás - endogén transzpozáz forrást tartalmazó legyekbe történő injektálás

24. Az embrionális fejlődés korai állapotai Megtermékenyített pete 30 percel megtermékenyítés után. A magi osztódások 10 percenként követik egymást egy sokmagvú sejtet a sinciciális blasztodermát létrehozva. Kb 9 osztódás után (512 mag) a sejtmagok kivándorolnak a felszínre A felszínen további négy osztódás történik. A sejteknek egy kis csoportja, a polsejtek kb. 2.5 óra múlva formalódnak a posterior végen. Ezekből lesznek a felnőtt állat ivarsejtjei. Három órával a megtermékenyítés után a sejtmagokat memrán zárja körül és a sejtek egy réteget képeznek az embrió felszínén, ez a sejtes blasztoderma állapot.

25. Az injektálás főbb technikai problémái • a pete belső nyomása • 2. az injektálás során keletkező „lyuk” befedése • Megoldások: • Az embrió kontrollált körülmények között végzett szárítása az injektálás előtt • -1971. Zalokar: a lyuk befedése heptánban oldott gum demarral • -1972. Ilmensee: kezelés 1.2 % sulfoszalicilsav oldattal • -Geyer-Duszynska: a beavatkozás halokarbon olaj alatt történik

26. Szükséges eszközök • Mikroszkóp, vibráció mentes asztal • Mikromanipulátor • Egyszerű mikromanipulátor elégséges. • Tű – tűhúzó • - kapilláris • A tű hegyének élesnek kell lennie, 1-10 mm átmérővel. • Injektáló rendszer • Lehetővé teszi a tű tartalmának folyását amikor az az embrióban van • és nem engedi azt amikor a tű az olajban van. • - vizzel töltött • - olajjal töltött • - levegős rendszer

27. Az injektálás menete • 0. A kívánt konstrukt előállítása • 1. Az emriók preparálása • - petéztetés • -dekorionálás • -sorbarakás Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó • -szárítás (a térfogat 1-5 %-a) • 2. Injektálás • 1-100 pl oldat • 3. Gondviselés

28. Összefoglalás donor DNS-t hordozó sejtmagok ivarsejt prekurzor marker w+ allél transzpozáz gén transzgén 3’-P hibás 5’-vég 5’-P nem autonóm P elem donor plazmid w- szemű GO állatok keresztezés nem transzformált, w- szemű állatokkal injektálás w- embriókba sejtmagok donor DNS-t hordozó és w+ szemű transzgénikus utódok w- szemű nem transzgénikus utódok