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XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de l’ADN couplée à la réplication. Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Louis Pasteur – Strasbourg I. Nicolas Lévy 22 novembre 2007.

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Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de l’ADN couplée à la réplication

Thèse présentée pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université Louis Pasteur – Strasbourg I

Nicolas Lévy

22 novembre 2007

Thèse réalisée au sein du département Intégrité Du Génome de l’ UMR 7175, ESBS, sous la direction de Josiane et Gilbert de Murcia

Dessin de N.Bouvier pour G.Almouzni


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

  • Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Les différents types de lésions de l’ADN

Réactions spontannées

Agents alkylants

Radicaux oxygénés

Rayons X

Rayons UV

Rayons X

Radiomimétiques

Erreurs de

la réplication

Modification de base:

Désamination spontanée,

Alkylation, Oxydation

Dimère de

thymine

Site

abasique

Cassure

simple-brin

(SSB)

Cassure

double-brin

(DSB)

Nucléotides

mésappariés

G

T

DSBR:

NHEJ

HR

NER

MMR

BER

SSBR

Adapté de D.M.Wilson III et al., Encyclopedia of RespiratoryMedicine, Ed. Elsevier, 2005


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

5'

P

OH

5'

FEN1

PARP-1

PNK

Polß

PARP-2

Polß

Réparation des cassures simple-brin de l’ADN (SSBR)

• Reconnaissance de la base endommagée

APE1

XRCC1

P

OH

• Reconnaissance de la cassure simple-brin (SSB)

PARP-1

5'

P

OH

5'

• Recrutement de XRCC1 assemblage du complexe de réparation

XRCC1

Lig3

g-Rays, ROS...

OH

P

PNK

• Traitement des extrémités de la lésion

XRCC1

Lig3

PARP-1

• Remplissage de la brèche

PARP-2

Lig3

XRCC1

Lig3

XRCC1

• Ligation des extrémités de la lésion

Adapté de Whitehouse et al. (2001) Cell 104, 107-117


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

LA famille PARP

Schreiber et al., Nature Reviews, 2006


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

La réaction de poly(ADP-ribosyl)ation

Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006

PARP-1

Poly(ADP-ribose)

(PAR)

ADN


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Les rôles de la poly(ADP-ribosyl)ation

PARylation des histones

Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006


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X-ray Repair Cross Complementing group 1, XRCC1

  • Protéine sans activité enzymatique : rôle de plateforme d’interaction et d’organisation

  • Deux domaines homologues à l’extrémité C-terminale de BRCA1 (BRCT)

  • Recrutée en quelques secondes au niveau des coupures de l’ADN sur le PAR synthétisé par PARP-1

Recrutement de XRCC1 au niveau des lésions de l’ADN

Anti-PAR Anti-XRCC1 DAPI + merge


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR)

  • Cassures double-brin de l’ADN (DSB):

  • Hautement toxiques pour la cellule : pertes de fragments de chromosomes, translocations...

  • Directes (rayonnements ionisants, drogues radiomimétiques)

  • Indirectes (réplication d’un ADN endommagé)

  • Deux voies de réparation des DSB:

  • Recombinaison homologue (RH) : phases S tardive et G2 du cycle cellulaire

  • Recombinaison non homologue (NHEJ) : tout au long du cycle cellulaire

HR

NHEJ

Rothkam et al., Mol. Cel. Biol., 2003


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Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR) par NHEJ

Ku70/Ku80

• Reconnaissance du DSB par Ku70/Ku80, sous-unités de DNA-PK

DNA-PKcs

DNA-PK

• Fixation de DNA-PKcs, assemblage de l’holoenzyme DNA-PK

• Alignement des deux extrémités de la lésion

• Ligation finale des deux extrémités de la cassure double-brin

LigIV/XRCC4/XLF

Helleday et al., DNA Repair, 2007


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction NHEJ :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Réplication de l’ADN NHEJ

  • Duplication fidèle du matériel génétique de la cellule avant sa division

  • Deux étapes principales : initiation et élongation

  • Initiation : synthèse d’un oligonucléotide ARN/ADN servant d’amorce aux ADN polymérases réplicatives

  • Elongation : recrutement de l’anneau de processivité PCNA et des ADN polymérase réplicatives hautement fidèles et processives

Brin discontinu

Initiation

Brin continu

Elongation


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Le complexe ADN polymérase NHEJa-primase

  • Complexetetramérique chargé de la synthèse des amorcesd’ARN/ADN nécessaires à l’initiation de la réplication et à la synthèse des fragments d’Okazaki

  • L’ADN primase p48-p58 synthétise la portion ARN des amorces

  • L’ADN polymérase a synthétise la portion ADN des amorces

  • L’ADN primase agit comme frein moléculaire au cours de la réplication de l’ADN (Jong-Bong Lee et al., Nature 439, 621-624)

  • p58 est la sous-unité régulatrice de l’ADN primase eucaryote

Arezi et al., TIBS, 2000


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction NHEJ :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Un rôle pour XRCC1 dans le coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Les cellules EM9 déficientes en XRCC1 présentent 12x plus d’échanges de chromatides sœurs (SCE) que les cellules sauvages (Dillehay et al., Mutat. Res., 1983)

  • La mutation du domaine BRCT1 entraîne une diminution de la survie des cellules après traitement au MMS (Taylor et al., Mol. Cell. Biol., 2002)

  • La mutation du domaine BRCT1 entraîne un défaut de redémarrage de la synthèse d’ADN après traitement au MMS (Kubota et al., Nucl. Acids Res., 2003)

  • XRCC1 interagit avec l’anneau de processivité PCNA et colocalise avec cette protéine au niveau des foyers de réplication (Fan et al., Nucl. Acids Res., 2004)

  • Les cellules traitées par ARN interférence dirigé contre XRCC1 s’accumulent en phase S 24h après traitement au MMS (Brem et al., Nucl. Acids Res., 2005)


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction et réplication de l’ADN ? :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

  • Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli

  • Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose

  • Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa

  • Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés

  • Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse

GST-

BRCT1

GST

DNA-PKcs

PARP-1

p58

Dimère

de GST

GST-BRCT1

PCNA

GST


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction domaine BRCT1 de XRCC1 :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

XRCC1 et p58 interagissent domaine BRCT1 de XRCC1in vitro

a

1-170

170-428

282-428

314-428

427-633

b

c

GST-XRCC1

d

GST a b c d e WB

e

XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase après traitement à l’hydroxyurée

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est suffisant pour l’interaction avec p58


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

XRCC1 interagit avec la moitié N-terminale de p58 domaine BRCT1 de XRCC1

XRCC1

p58

N

C

NLS

1 6 12 G266 509

Amido black

Far western blot Anti-XRCC1


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

XRCC1 et p58 interagissent domaine BRCT1 de XRCC1in vivo

-HU +HU

DAPI+Merge XRCC1 p58

XRCC1 et p58 colocalisent dans les foyers de réplication des cellules traitées par hydroxyurée


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Le poly(ADP-ribose) et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58

par sa moitié N-ter

p58 lie le PAR

Test de mobilité électrophorétique:

Le PAR et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58

Le PAR inhibe la liaison de p58 à

l’ADN substrat


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

La fixation de PAR par p58 inhibe l’activité primase de p48-p58 in vitro

Influence du PAR sur l’activité primase

La liaison du PAR à p58 inhibe fortement l’activité primase du complexe p48-p58


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux élevés de PAR

DAPI GFP-BRCT1 Anti-PAR Colocalisation

+H2O2 Contrôle

Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent une forte automodification de PARP-1 et une forte hétéromodification de XRCC1 au niveau de son domaine BRCT1

Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux significatifs de PAR nucléaire en absence de traitement, et des niveaux très élevés de PAR après endommagement de l’ADN


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

XRCC1 est nécessaire à la progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé

2n 4n 2n 4n

La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 perturbe fortement la progression des cellules à travers le cycle cellulaire, après traitement au MNU


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 inhibe la progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé

La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 entraîne une accumulation des cellules en début de phase S : la réplication est inhibée, ralentie


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Microinjection, progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé

Extraits d’œufs ,

Réplication in vitro

Le modèle Xenopus laevis

  • Xenopus laevis:

  • Allotétraploïde

  • 36 chromosomes

  • 20-22°c température optimale de croissance

  • ♀11cm /♂6cm

  • œufs 1,2-1,3 mm Ø

  • 1000 à 6000 œufs/ponte

  • temps de génération

  • >2 ans


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Extraits d’oeufs de xénope progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé

Formation d’une

Membrane nucléaire

Cycle unique et complet de réplication de l’ADN

ADN

matrice

Addition de protéines recombinantes (BRCT1 / BRCT2)

Système acellulaire :

Immunodeplétion (anticorps anti-XRCC1)

Traitement de la chromatine par des agents génotoxiques

Utilisation d’inhibiteurs PARP/PARG

Réplication de l’ADN dans les extraits d’œufs de xénope

  • Analyse des cinétiques de réplication

  • Analyse des protéines (WB, IF)

  • Analyse de la taille des ADN synthétisés


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Xenopus egg progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé

extracts

HeLa cells

@XRCC1

Pc souris A

Xenopus egg

extracts

HeLa cells

@PARP1

Pc souris EGT69

XRCC1 est une protéine fortement conservée au cours de l’évolution

~ 80% d’homologie de séquence entre la protéine humain et celle de xénope

> 90% d’identité de séquence au niveau du domaine BRCT1


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

X.l. XRCC1 BRCT1 ralentit la réplication des ADN endommagés

Tailles des ADN répliqués

Analyse des cinétiques de réplication de l’ADN

Chromatine non traitée

Chromatine traitée MMS

Analyse de la taille des ADN répliqués sur gel alcalin

L’addition de GST-BRCT1 recombinant dans les extraits d’œufs de xénope freine la réplication des ADN endommagés


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

X.l. XRCC1 BRCT1 bloque l’initiation de la réplication des ADN endommagés

Accumulation de complexes de pré-initiation

Défaut d’association de PCNA sur la chromatine

 Inhibition de l’initiation de la réplication


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par XRCC1 BRCT1 est dépendant de sa PARylation

+ GST

+ GST-BRCT1

+ inhibiteur PARP KU0058948

+GST-BRCT1

Analyse des cinétiques de réplication de la chromatine endommagée au MMS

L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par le domaine BRCT1 de XRCC1 dépend de sa modification par PARP-1


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Modèle : XRCC1 interagit avec p58 pour freiner la réplication des ADN endommagés afin de préserver l’intégrité du génome


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction réplication des ADN endommagés afin de préserver l’intégrité du génome :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

  • Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli

  • Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose

  • Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa

  • Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés

  • Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse

GST-

BRCT1

GST

DNA-PKcs

PARP-1

p58

Dimère

de GST

GST-BRCT1

PCNA

GST


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1 domaine BRCT1 de XRCC1

a

1-170

170-428

282-428

314-428

427-633

b

c

GST a b c d e

GST-XRCC1

d

e

Far western blot

Anti-XRCC1

XRCC1 interagit avec les 3 sous-unités de DNA-PK

DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK sur son domaine BRCT1 en réponse aux rayons ionisants

a

1-170

170-428

282-428

314-428

427-633

b

GST a b c d e

c

GST-XRCC1

d

e

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vivo par DNA-PK en réponse aux rayonnements ionisants

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vitro par DNA-PK


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK au niveau de sa sérine 371

DNA-PK

S371

Un seul motif potentiel de phosphorylation par DNA-PK de type SQ au sein du domaine BRCT1 de XRCC1 : SQ 371/372

La sérine 371 de XRCC1 constitue le site de phosphorylation par DNA-PK


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

XRCC1 371

XRCC1 dimérise via son domaine BRCT1 et la phosphorylation de la sérine 371 entraîne la dissociation du dimère XRCC1

a

1-170

170-428

282-428

314-428

427-633

b

c

GST-XRCC1

La phosphorylation de la sérine 371 entraîne la dissociation du dimère XRCC1

d

e

DNA-PK

P

P

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est une interface de dimérisation

XRCC1

XRCC1

BRCT1

BRCT1


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

P53 371

P

S15

GST

Le dimère XRCC1 stimule l’activité kinase de DNA-PK in vitro

XRCC1 stimule fortement l’activité kinase de DNA-PK

C’est la forme dimère de XRCC1 qui possède cette capacité à stimuler DNA-PK


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

Le mutant S371L de XRCC1 entraîne la persistance de cassures double-brin de l’ADN

EM9

XRCC1 wt

EM9 XRCC1

S371L

EM9

(Déficientes en XRCC1)

NT

1Gy/1H

Immunofluorescence: anti-gH2AX

Foyers gH2AX = sites de cassures double-brin de l’ADN

Le mutant non phosphorylable S371L de XRCC1 entraîne une persistance des DBS alors qu’il est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK

Le dimère XRCC1 est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK, mais sa dissociation est importante pour la suite du mécanisme de réparation des DSB


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Modèle : XRCC1 agit comme commutateur entre les voies cassures double-brin de l’ADN

de SSBR et DSBR


Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction cassures double-brin de l’ADN :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


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XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 du complexe ADN polymérase a-primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK et stimule l’activité de cette kinase pour favoriser la réparation des DSB générés lors de la réplication de l’ADN

PARP-1 interagit avec l’ADN polymérase a et inhibe son activité en l’hétéromodifiant

(Eki et al., FEBS Letters , 1994; Simbulan-Rosenthal et al., Biochemistry, 1996; Dantzer et al., Nucl. Acids Res., 1998)

PARP-1 interagit avec DNA-PK et stimule son activité kinase en l’hétéromodifiant

(Ruscetti et al., J. Biol. Chem., 1998)

XRCC1 et PARP-1 forment un couple étroitement lié et agissent de façon synergique pour inhiber la réplication des ADN endommagés et pour organiser la transition entre SSBR et DSBR



Xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

  • Introduction réplication de l’ADN :

    • Les différents types de lésions de l’ADN

    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1

    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ

    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase

    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Résultats :

    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN

  • Discussion et perspectives :

    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses


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XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses réplication de l’ADN

Chimiothérapies, radiothérapies : endommagement de l’ADN de cellules tumorales pour provoquer leur mort.

Limites : effets secondaires sur les cellules saines de l’organisme, résistance des tumeurs

Inhibition des voies de réparation de l’ADN : potentialisation des traitements anticancéreux

Inhibiteurs PARP : potentialisation des traitements par irradiation

effet important sur les tumeurs liées à BRCA1/2

Bryant et al., Nature, 2005

G. Noël et al., Mol. Cancer Ther., 2006


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XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses réplication de l’ADN

Inhibition des fonctions du domaine BRCT1 de XRCC1 : perturbation de la prise en charges de lésions au cours de la réplication ainsi que du NHEJ

Aptamère (court oligonucléotide à structure tridimensionnelle complexe) :

Forte affinité pour une cible protéique spécifique

Inhibition des fonctions de la cible liée

Peptide inhibiteur, se liant en dominant négatif au domaine BRCT1 de XRCC1 et empêchant les interactions protéiques normalement assurées par ce domaine

  • Accumulation importante de lésions dans l’ADN

  • Ciblage spécifique des cellules tumorales en prolifération


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DEPARTEMENT “INTEGRITE DU GENOME” DE réplication de l’ADNl’UMR 7175

ECOLE SUPERIEURE DE BIOTECHNOLOGIE DE STRASBOURG UNIVERSITE LOUIS PASTEUR

LRC-CEA n° 39boulevard Sébastien Brant, BP 10413

F-67412 IllkirchCedex, France

Un grand merci :

A tout le département « Intégrité Du Génome » de l’ESBS :

Au jury :

Directeur de thèse : Dr. Gilbert de Murcia

Rapporteur interne : Pr. Philippe Carbon

Rapporteur externe : Dr. Janet Hall

Rapporteur externe : Dr. Pablo Radicella

Examinateur : Dr. Domenico Maiorano

Invitée : Dr. Anne Bresson

Au Dr. Marcel Méchali et à tout le laboratoire « Surveillance et Stabilité du Génome » de l’Institut de Génétique Humaine de Montpellier

A Josiane Ménissier de Murcia, Directrice de thèse

Laboratoire de

recherche

associé n° 39V

http://parplink.u-strasbg.fr


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Activité spécifique : Sa = (CPM réplication de l’ADNi x Fd)/(CdATPxV) (cpm/pmol dATP)

Quantité de dATP incorporée : ndATP = (CPM x Fd)/Sa (pmol)

Masse des nucléotides incorporés : m = ndATP x 4 x 0,33 (ngr)

Pourcentage d’ADN répliqué = m / mchromatin



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Perspectives réplication de l’ADN

Conclusions

La réplication de l’ADN est inhibée par l’interaction entre le domaine BRCT1 (PAR)ylé de XRCC1 et la sous-unité p58 de l’ADN primase, en réponse au stress génotoxique, afin de maintenir l’intégrité du génome (évite les collisions entre les fourches de réplication et les SSB non réparés, susceptibles de générer des DSB hautement toxiques)

Arrêt de la réplication par inhibition de l’ ADN primase par le ppGpp en response stress nutritionel (Wang et al. Cell 128, 865-875)

Stabilisation de la machinerie réplicative sur un ADN endommagé grâce à l’ATP généré lors de la dégradation du PAR (Maruta et al. Biol. Pharm. Bull. 30, 447-450)

Etude dans un modèle déficient pour XRCC1 (cellules EM9, extraits d’oeufs de xénope déplétés pour XRCC1…)

Etude de la réplication sur un substrat synthétique avec des lésions localisées