Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique

1. Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique Histologie Faculté de médecine Saint-Antoine NM 08/2004

3. Principes généraux • échantillonnage du prélèvement, • fixation, • deshydratation, • inclusion (paraffine, résine), • coupe, • colorations, • observation.

4. I- Les coupes histologiques • 3 à 5 µm d’épaisseur, • quelques centimètres de largeur et longueur, • nombreuses colorations possibles, • montées entre lame et lamelle, • grandissement de 10 à 1000 fois (environ).

5. Techniques de fixation • Immersion dans le fixateur • la technique la plus utilisée (routine). • Perfusion intravasculaire ou intraluminale • très bonne fixation, • délicate à mettre en place, • pour la recherche.

6. Fixation Elle doit : • être rapide, • permettre des colorations topographiques, • permettre l’immunohistologie, • être peu ou pas toxique. • préserver les structures tissulaires et cellulaires, • éviter les artefacts (gonflements, rétractions),

7. Il n’y a pas de fixateur idéal • Il faut le choisir en fonction de ses avantages et inconvénients. • Parmi des centaines disponibles !

8. bon marché, • incolore, • permet la fixation de grosses pièces, • permet l’immunohistologie • le formol seul (formaldéhyde dilué) dans l’eau courante, ou tamponné MAIS • allergisant, • carcinogène.

9. AFA (Acide acétique Formol Alcool) • Les fixateurs contenant du formol (1) • très rapide (risques de surfixation), • permet les marquages immunohistologiques. MAIS • peu pénétrant. idéal pour les biopsies

10. Les fixateurs contenant du formol (2) • rapide, • pénétrant, • légères rétractions tissulaires, • très belles colorations topographiques, • Bouin (Acide acétique Formol Acide picrique) MAIS • ne permet que difficilement l’immunohistologie, • coloré : tache ! (et ne part qu’avec l’épiderme). Idéal pour voir des gg. lymphatiques dans le tissu adipeux

11. Quel que soit le fixateur, le prélèvement doit être échantillonné et la taille des échantillons adaptée à celle de la cassette d’inclusion.

12. Deshydratation L’eau tissulaire est remplacée par de la paraffine. Mais ces milieux ne sont pas miscibles entre eux. On procède donc par étapes en remplaçant : • l’eau par un alcool, • l’alcool par un solvant organique, • le solvant par la paraffine

13. Deshydration et Inclusion : l’automate les bacs contiennent • des alcools (5 bains), • des solvants organiques (5 bains), • de la paraffine chaude (3 bains). Remarque : machine historique ! Elle a 40 ans et fonctionne toujours !

14. Confection du bloc : Enrobage

15. Un moule est rempli de paraffine liquide

16. Le prélèvement est mis en place et le bloc mis à refroidir

17. Démoulage, après refroidissement

18. Mise en place du bloc sur le microtome

19. Confection des coupes : le ruban

20. Etalement sur lame

21. Séchage avant coloration

22. Les colorations sont infinies.Ne vous fiez pas à la couleurpour « reconnaître » une structure !

23. Observations, photographies.

24. Résultat surprise Poumon de chien

25. Et n’oubliez pas ….De remettre vos lames dans les boîtes,vous nous aiderez !

26. Microscopie électronique • Quelques millimètres de largeur et longueur, • 60 à 100 nanomètres d’épaisseur, • coupe déposée sur une grille métallique, • rares colorations possibles, • grandissement de 1000 à 100.000 fois.

27. Les blocs • environ 2 mm3 de tissu, • fixation immédiate glutaraldéhyde / tétroxyde d’osmium, • inclusion en résine, • imprégnation par métaux lourds (plomb).

28. Coupe (dégrossissage au couteau de verre)

29. Coupe ultra-fine (couteau diamant)

30. Les coupes sur grille métallique

31. Le (vénérable) microscope électronique de la fac’

32. Mise en place de la grille

33. Observation

34. Mise au point, observation

36. En microscopie optique, les plus forts grandissements sont : X 400 X 1 000

37. En microscopie électronique, le plus fort grossissement estx 100 000. Les plus couramment utilisés sont entre x 3 500 et x 50 000 X 40 000