Olika katalyseringsstrategier hos enzymer - summarisk översikt

1. Olika katalyseringsstrategier hos enzymer - summarisk översikt • Allmän syra/bas katalys: i) Allmän bas katalys - en bas stabiliserar en positiv laddad grupp i TS, ii) Allmän syra katalys - en syra stabiliserar en negativ laddad grupp i TS • Approximation (Proximitet av reaktanter): Närhet av reaktanter leder till lägre entropiförlust vid en enzymkatalyserad reaktion under de kemiska stegen jämfört med icke enzymkatalyserad reaktion. • Elektrostatisk katalys: Enzymer kan stabilisera joner och andra laddningar (t o m mer effektivt än vatten) pga orienterade dipoler i aktiva ytan • Metalljonkatalys: i) Elektrofil katalys – koordinerad metalljon som stabiliserar en bildande negativ laddning, ii) Hydroxyljonskatalys vid neutralt pH – Koordinerande metalljon som inbinder vatten och underlättar deprotonisering till hydroxyljon vid neutralt pH. Hydroxyljonen kan sedan reagera med substratet via en nukleofil attack • Kovalent katalys: i)Elektrofil katalys – ny katalysväg med bildandet av en bättre elektrofil än ursprungselektrofilen (ex bildandet av Schiff bas, e- stabiliseras genom delokalisering), Nukleofil katalys – ny katalysväg med en bättre nukleofil än ursprungsnukleofilen och där intermediären är mer reaktivt än vad substratet är • Konformationsförändring (Conformationaldistortion) – strukturförändring av enzymet, substratet eller båda för att föra systemet mot TS (inducetfit and inducedstrain)

2. Kovalentkatalys • 11. Ge ett exempel och förklara reaktionsmekanismen för: • Nukleofil katalys – ny katalysväg med en bättre nukleofil än ursprungsnukleofilen och där intermediären är mer reaktivt än vad substratet är Exempelvis hydrolys av ättiksyraanhydrid underlättas av pyridin Nukleofil attack med pyridin som är en bättre nukleofil än H2O Det bildas ett intermediat som är mer reaktivt än ursprungssubstratet

3. Kovalentkatalys Nukleofilkatalys -

4. Kovalentkatalys • 12. Diskutera vilka faktorer som är av betydelse för reaktionshastighet hos en nukleofil katalys vid hydrolys av en ester? Mät förändringar i reaktivitet med förändringar i strukturen hos reagensen • Hastigheten för en hydrolys av en ester ökar då: • Karbonylkolet är kopplat till elektrondragande grupper i acylpositionen • (CHCl2CO2Et > CH3CO2Et) • ii) elektrondragande grupp i lämnande gruppen • iii) ökad basisk styrka hos nukleofilen Elektrondragande grupp i acylpositionen Elektrondragande grupp i lämnande gruppen Ökad basisk styrka hos nukleofilen

5. Kovalentkatalys nukleofilkatalysvidhydrolysav en ester Tillämpa transitionsstate teorin - reaktionshastigheten beror på energiskillnaden mellan TS och grundtillståndet → så kan vi dra slutsatsen att: Reaktionen involverar en ökning av negativ laddning på substratet (eftersom reaktionshastigheten ökar med elektrondragande grupp) Reaktionen måste involvera en minskning i laddning hos nukleofilen (eftersom hastigheten ökar vid elektrondonation) Detta är förenligt med båda reaktionsmekanismerna nedan Det hastighetsbegränsande steget är formation av ett tetraedriskt intermediat Det hastighetsbegränsande steget är nedbrytning av ett tetraedriskt intermediat

6. Kovalentkatalys nukleofilkatalysvidhydrolysav en ester • Brønsted β värde för en nukleofil katalys fås genom att plotta logk2 mot pKa för olika nukleofiler Linjärt samband mellan logk och pKa ΔG# för formation av bindning mellan den nukleofila gruppen och karbonylkolet är proportionellt mot ΔG för överföring av en proton till nukleofilen R NH2 A Bronstedplot för nukleofil attack av primära och sekundära aminer på p-nitrofenylacetat RNH2 + H+ RNH3+

7. Kovalentkatalys nukleofilkatalysvidhydrolysav en ester • Brønsted β är inte strikt mellan 0 och 1 - kan vara större än 1 om den reaktiva gruppen är mer elektrondragande än en proton . β-värdet indikerar laddningsfördelningen i TS • β för nukleofil attack av tertiära aminer på estrar med starka basiska alkoholer är: • + 1.5 för variation av nukleofilenspKa (hastigheten ökar med stigande basstyrka) • - 1.5 för variationen av alkoholens pKa (hastigheten minskar med stigande basstyrka) I detta fall liknar TS strukturen den bildade produkten Det hastighetsbegränsande steget är nedbrytning av ett tetraedriskt intermediat

8. Kovalentkatalys nukleofilkatalysvidhydrolysav en ester I ett annat extremt fall • β för reaktion med basiska nukleofiler och estrar som innehållen en aktiverad lämnande grupp är: • + 0.1 till 0.2 för variation av nukleofilenspKa (marginell ökning av hastigheten med stigande basstyrka) • - 0.1 till 0.2 för variationen av den lämnande gruppens pKa (marginell minskar av hastigheten med stigande basstyrka) I detta fall liknar TS strukturen startmaterialet Det hastighetsbegränsande steget är formation av ett tetraedriskt intermediat

9.  1. Diskutera vilken information om en enzymatisk reaktion kan man få genom ”steadystate” kinetik versus ”pre-steadystate” kinetik. Steadystate kinetik – visar med vilken hastighet produkt bildas och/eller substrat förbrukas under steadystate förhållanden. Ger ingen information om antal intermediärer. Här kan vi beräkna KM, kcat och kcat/KM Pre-steadystate kinetik – direkt observation av intermediärer i reaktionsvägen och deras hastighet av bildning och nedbrytning kan beräknas. Pre-steadystate kinetik ger information om reaktionsmekanismen genom att påvisa uppkomst av intermediat och dess försvinnande.

10.  2. Om inget intermediat kan detekteras i ”pre-steadystate” vad kan det då bero på? Odetekterade intermediat i pre-steadystate kan bero på: a) Ingen accumulering av intermediet b) Intermediatet ger ingen spektral signal c) Intermediatet bildas så snabbt att det ej kan detekteras. 3. Vilka kriterier måste vara uppfyllda för bevis att ett intermediat bildas i reaktionskedjan? Ett intermediat är bevisat att vara ”on pathway” om: a) intermediatet är isolerat och karaktäriserad + b) intermediatet bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” + c) intermediatet kan reagera tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

11. Detektion av intermediär genom dess ackumulering i ”burst-fas”, Hydrolys av en amid/ester katalyserad av chymotrypsin kan beskrivas med följande schema: E = Enzym, S = Substrat, EI = Acylenzym, P1 = Amin och P2 = Karboxylsyra k’1= apparent första ordningens hastighetskonstant för formationen av P1 k3 = Hastighetskonstantenför formation avP2 • Burstfasen är den initiala fasen som bildas innan jämvikten ställt in sig • Om [S] > [E] samt om förhållandet mellan k’1 och k3 är stort (i.e. k’1 >> k3) kommer ”burst-fasen” ha samma koncentration som [E]0 som då befinner sig i formen [EI] Uppkomsten av en burst-fas visar på snabb formation av intermediatet EI

12. k2 Ks E+S ES E+P k2 Ks E+S ES E’+P Burst fas Formation av P1 över tid [P1] Tid Burst fas  4. Vilka andra händelser (utöver ackumulering av ett intermediat) kan resultera i en ”burst-fas”? visa med exempel på reaktions scheman Vi tänker oss följande reaktion som inte innehåller någon intermediär a) Enzymet kan omvandlas till ett mindre reaktiv tillstånd i kombination med att det reagerar med de första substratmolekylerna k2 >> k’2 k’2 K’s E’+S E’S E’+P linjär fas Burstfas - Snabb produktion av P då en viss mängd S binder in till allt E Linjär fas – Långsam produktion av P vid reaktion med E’

13. k’2 k2 Ks [EP] E+S E+P ES EP [S] Linjär fas Burst fas Tid Tid Linjär fas Burst fas b) Dissociering av produkten är hastighetsbegränsande k2 >> k’2 Burstfas bildas från den första mängden S som försvinner eller EP som bildas. Långsam minskning av S eller ökning av EP fås genom en fördröjning i återanvändningen av E pga långsam dissociering av EP i) Burstfas - Snabb åtgång av S då en viss mängd av S reagerar med allt E till EP ii) Linjär fas - Långsam åtgång av S som speglar den långsamma återanvändningen av E från EP iii) Burstfas – Snabb produktion av EP då en viss mängd S reagerar med allt E → EP iiii) Linjär fas – Långsam produktion av EP som speglar den långsamma återanvändningen av E från EP

14. [EP] [S] Linjär fas k’2 k2 Ks E+S E+P ES EP Burst fas k’2 k2 Ks Tid Tid Linjär fas Burst fas E+S E+P ES EP -P EP c) Enzymet inhiberas av produkten k2 >> k’2. Burstfas bildas från den första mängden S som försvinner eller EP som bildas. På samma sätt som i fallet b fås en långsam minskning av S eller ökning av EP genom en fördröjning i återanvändningen av E pga inhibering av P. i) Burstfas - Snabb åtgång av S då en viss mängd av S reagerar med allt E till EP ii) Linjär fas - Långsam åtgång av S som speglar den långsamma återanvändningen av E pga inhibering av P iii) Burstfas – Snabb produktion av EP då en viss mängd S reagerar med alle E → EP iiii) Linjär fas – Långsam produktion av EP som speglar den långsamma återanvändningen av E pga inhibering av P

15.  5. Visa hur man kan studera k2 genom att a) använda en kromofor som lämnande grupp, b) använda en kromoforacylgrupp samt c) använda en kromofor inhibitor till E. Rita grafer!! Hydrolys av amider och estrar katalyserat av ett serinproteas (kymotrypsin) Ks k2 k3 EI E+S ES E+P2 +P1 • Villkor mätbetingelser: • Enzymet mättas med S ([E] < [S]) vilket ger en ackumulering av ett stabilt intermediat (EI) över en viss begränsad tid, då det finns tillräckligt med S för att hålla enzymet mättat ES. • Beräkning av k2 mäts under ”single-turnover” betingelser, ingen återanvändning av enzymet.

16. [P1] Linjär fas Exponentiell fas Tid a) kromofor som lämnande grupp: Hastigheten för produktion av acylenzym (EI) bestäms från hastigheten av produktion av P1 (nitrofenol alt joniserad form av nitrofenol) som absorberar ljus vid en annan våglängd än esterföreningen. Ks k2 k3 EI E+S ES E+P2 +P1 • Hastighetskonstanten för acylering (k2) samt dissocieringskonstanten (Ks) kan beräknas från den exponentiella fasens hastighetskonstants beroende av [S]. • Olyckligtvis är nitrofenylestrar oftast så reaktiva att acyleringshastigheten är för hög för att mätas med ”stop flow”

17. b) Använda en kromoforacylgrupp: Exempelvis furylacryloyl-L-tyrosine etyl ester, vars spektrum förändas vid inbindning till enzym. Absorbans Om absorbansen ökar vid inbindning! Ackumulering av EI Ks k2 k3 EI E+S ES E+P2 Produktion av ES inom dödtid +P1 Tid • Spektrum av furylacryloyl-L-tyrosine etyl ester ändras när det binder till E (i.e. ES) • Spektrum ändras ytterligare vid ackumuleringav EI. • Under den exponentiella fasen ackumuleras EI, ger k2.

18. Dissociering av Epro Produktion av ES Beräkning av Ks Brist på substrat → minskning av EI (hydrolysen detekteras)→ ökning av Epro A465 S,Ks k2 k3 Produktion av EI, beräkning av k2 EI E ES E+P2 +P1 pro Epro Tid Abs konstant tills S är förbrukad c) Använda en kromofor inhibitor till E som snabbt kan dissociera från E : Exempelvis proflavin (pro) - ger en ökning i Abs vi inbindning till E. • Snabb minskning i Abs får genomsnabb dissociering av Epro och snabb formation av ES. S konkurrerar ut pro. • Exponentiell minskning av Abs fås då EI bildas vilket leder till att mängden fri E som kan binda till pro minskar. Från dessa fas kan k2 beräknas • Abs är konstant så länge det finns nog med S som försäkrar att E är acylerat (i.e.EI) • Efter en tid stiger abs då S börjar ta slut [EI] minskar och [E] ökar som kan binda till pro.

19. k3 EI E+P2 pro Epro •  6. Förklarakortfattathur man kanstuderak3 A465 Ks k2 k3 EI E+S ES E+P2 Tid +P1 • Man måste först hitta ett substrat som kan bilda EI mkt fort och som kan ackumuleras som EI dvs all substrat som tillsätts ska först binda till enzymet och bilda EI (k2>> k3). Därefter sker en långsam hydrolys under ”singel-turnover” betingelser som detekteras genom att tillsätta en kromafor-inhibitor som binder in till enzymet då EI övergått till E + P. Det sker alltså en absorbans-förändring då kromofor-inhibitorn (ex proflavin) binder till enzymet - denna kurva kan i sin tur relateras till k3. • EI kan isoleras genom att förvara den vid ett pH där den är oreaktiv. På så sätt isolerar man steget man vill studera. k3 kan sedan beräknas genom att vid ett stop-flow-försök höja pH till reaktiva nivåer och spektroskopiskt mäta hur inbindningen av en kromafor-inhibitor till E varierar med tiden.

20. RCOX kcat RCOY RCO-E RCO2H+E RCOZ  7. Diskutera värdena på kcat och KM i tabell 7.1 – vilken information kan fås om det hastighetsbegränsade steget samt förekomsten av ett gemensamt intermediat för olika substrat inom samma klass. Vid hydrolys av en ester och amider med kymotrypsin bildas ett intermediat (RCO-E) Acylation Deacylation kcat = k2k3/(k2 + k3) KM = Ksk3/(k2 + k3) Om flera substrat genererar samma intermediat och om nedbrytning av intermediatet är hastighetsbegränsande så hydrolyseras dessa med samma kcat!! • För estrar får samma värde på kcat → Deacylering är hastighetsbegränsande • k2 >> k3 (kcat= k3)och KM = Ksk3/k2 (Lågt värde på KM - synligt i tabellen) • För amider är fås ett lågt värde på kcat→Acyleringssteget är hastighetsbegränsande kcat= k2 • För amider är k2<< k3 och KM = Ks(Högt värde KM- synligt i tabellen) Den högre reaktiviteten för p-nitrofenylester speglas i ett lägre KM pga k2 ökar vid bättre lämnande grupp

21. A RCOA+E E+RCOOR’ RCO-E B RCOB+E R’-OH •  8. Förklara principen för hur fördelning av intermediärer mellan tävlande acceptorer kan visa på förekomsten av ett gemensamt intermediat. Bestäm fördelningen mellan olika produkter vid hydrolys av olika substrat-derivat (i.e. R’ varierar): Om produktfördelningen A/B är lika för den enzymkatalyserade reaktionen oavsett egenskap hos R’ så är detta ett bra bevis för formation av det gemensamma intermediatet RCO-E Ex kymotrypsin katalyserad hydrolys av olika estrar i närvaro av hydroxylamin och vatten E+RCOOR’ NH2OH RCONHOH+E R’ RCO-E H2O RCO2H+E R’-OH Produktfördelningen är konstant för den enzymkatalyserade reaktionen!

22.  9. Diskutera utifrån figurerna 7.2 och 7.3 hur man kan avgöra om det hastighetsbegränsande steget är formation eller hydrolys av acylenzyme. Mät hastigheten för formation av produkt från ett visst substrat vid olika koncentrationer av acceptor [A] k2 k3 E+RCOOR’ RCO-E RCOA+E A R’-OH • i) Om det hastighetsbegränsande steget är formation av RCO-E (acylenzym) så kan en högre koncentration av A inte öka hastigheten för reaktionen då A reagerar med RCO-E efter det hastighetsbegränsande steget – k2 är hastighetsbegränsande • ii) Om det hastighetsbegränsande steget är hydrolys av RCO-E så leder en högre koncentration av A till en ökad hastighet för reaktionen – k3 är hastighetsbegränsande

23. -Ac-Phe-TMA kcat (s-1) Ac-Phe-Ala-NH2 Ac-Phe (hydrolys med H2O) Ala-NH2 [Ala-NH2] (M) Ac-Phe-Ala-NH2 Ks k2 E•Ac-Phe-TMA E+Ac-Phe-TMA Ac-Phe-E H2O Ac-Phe TMA-OH Figure 7.2. Hydrolysav Ac-Phe-TMA = Acetylphenylalaninp-trimetylammoniumanilide • kcat för produktion av Ac-Phe-Ala-NH2 ökar med ökad [Ala-NH2] • kcat för produktion av Ac-Phe minskar med ökad [Ala-NH2]. • kcatför minskning av [Ac-Phe-TMA] är konstant med ökad [Ala-NH2]. k2 är hastighetsbegränsande: Formation av acylenzym är hastighetsbegränsande då ökning av [Ala-NH2] inte ökar hastigheten för nedbrytning av Ac-Phe-TMA

24. -Ac-Phe-O-CH3 kcat (s-1) Ac-Phe-Ala-NH2 Ac-Phe (hydrolys med H2O) [Ala-NH2] (M) Figure 7.3. Hydrolys av Ac-Phe-OCH3 = Acetylphenylalanin – metyl ester Ala-NH2 Ac-Phe-Ala-NH2 Ks k2 E•Ac-Phe-OCH3 E+Ac-Phe-OCH3 Ac-Phe-E H2O Ac-Phe • i) kcat för produktion av Ac-Phe-Ala-NH2 ökar med ökad [Ala-NH2] • ii) kcat för produktion av Ac-Phe minskar med ökad [Ala-NH2]. • iii) kcatför minskning av [Ac-Phe-OCH3] ökar med ökad [Ala-NH2] CH3OH k3 är hastighetsbegränsande: Hydrolys av acylenzym är hastighetsbegränsande då ökning av [Ala-NH2] ökar hastigheten för nedbrytning av Ac-Phe-OCH3

25. E + ATP + AA + tRNA E•AA-AMP + tRNA AA-tRNA + AMP + E PPi • 10. Förklara hur man kunnat bevisa reaktionsvägen för reaktionen: Till syntes av proteiner E = aminoacyl-tRNAsynthetase Nettoreaktion: E kan hydrolysera ATP och bilda komplexet Aminoacyl-tRNA (AA-tRNA) • Hur har man bevisat att reaktionen går via ackumulering av intermediatet E•AA-AMP (enzymbundet aminoacyladenylat) och inte via intermediatetE•AA-tRNA Test för formation avE•AA-AMP: • Med pyrofosfasutbytes-tekniken: E+ATP+AA+32PPi E•AA-AMP+PPi+32PPi • I frånvaro av tRNAerhålls en jämn fördelning av isotopinmärkt P i ATP och PPi • Detta kan förklaras av en ständig återanvändning av E•AA-AMP (som attackeras av 32PPi) • Alltså: reaktionen går via formation av komplexet aminoacyladenylat (E•AA-AMP) E•AA-AMP+PPi+32PPi E+32ATP+AA+PPi

26. Efter formation av E•AA-AMP skeracyleringenavtRNA tRNA laddat med AA E•AA-AMP enzymbundet aminoacyladenylat Bevis för formation av E•AA-AMP: • Intermediatet (E•AA-AMP) kan isoleras med kromatografi • Fritt aminoacyladenylat(AA-AMP) har isolerats genom fällning av enzymet med en syra • Det isolerade komplexet kan överföra sin aminosyra till tRNA • Kristallstrukturen av E•AA-AMP harbestämtsmed tyrosyl-tRNAsyntase (E) bundet till tyrosyladenylat (AA-AMP)

27. Från ovanstående resonemang är det logiskt att med följande reaktionsmekanism Men trots detta fanns det tveksamheter huruvida E•AA-AMP verkligen ackumulerades under reaktionen och om det istället inte var så att tRNA reagerade samtidigt som ATP hydrolyseradesenl: • Aminoacyladenylat mekanismen har bevisats genom ytterligare 2 villkor – studier av IRS (isoleucyl-tRNAsynthetase ) • E•AA-AMP reagerar tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” • E•AA-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

28. i) E•Ile-AMP reagerar tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” Fig 7.4 Studera reaktionen: E•(14C)Ile-AMP + tRNA → (14C)Ile-tRNA + AMP + E • ● (mix av E•(14C)Ile-AMP+ tRNA) och ο (mix av E + (14C)Ile + ATP + tRNA) ger samma hastighet → Detta innebär att E•(14C)Ilr-AMP reagerar tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” • k för överföring av (14C)Ile till tRNA är lika med kcat för ”steadystate” aminoacylering av tRNA under samma betingelser • Detta innebär att nedbrytning av E•(14C)Ile-AMPär hastighetsbegränsande (k = kcat) • En logiskreaktionsmekanismärdå: • om k > kcat → ett tidigare steg är det hastighetsbegränsande steget! • om k < kcat→E•AA-AMP kan inte existera som intermediat då det reagerar för långsamt! k

29. ii)E•Ile-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” Figur 7.5 - Då man mixar IRS + (γ-32P)ATP + Ile + tRNA fås en burstfas från produktion av 32PPi

30. i) E•Ile-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” Detta är förenligt med reaktionsmekanismen: Två olika intermediat Eller med reaktionsmekanismen: Den senare reaktionsmekanismen kan motbevisas:

31. i) E•Ile-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” Figur 7.6: Då man mixar IRS + ATP + (14C)AA + tRNA fås inte någon burstfas som skulle kunna visa på snabb produktion av E•(14C)AA-tRNA Alltså gäller:

32. 10. Förklara och diskutera hur man mha ”rapid quenching experiments” kommit fram till att editeringsmekanismen för bortstötning av felplacerad threonin involverar en felkoppling av Thr till tRNAVal följt av en snabb hydrolys. Proofreading vid proteinbiosyntes kan bero på: • i) Hydrolys av felaktigt komplex E•AA-AMP (aminoacyl komplex) av E (aminoacyl-tRNAsynthetase) ii) Hydrolys av ”mischarged” AA-tRNA

33. VRS + ATP + Thr + 32PPi VRS•Thr-AMP + PPi+ 32PPi VRS•Thr-AMP + PPi+ 32PPi VRS + 32ATP + Thr + PPiosv i) Argument för formation av det felaktiga komplexet VRS•Thr-AMP: VRS = Valyl-tRNAsynthetase • Pyrofosfatutbytestekniken: 32P blir jämt fördelad mellan ATP och PPi Detta kan förklaras av en ständig återanvändning av VRS•Thr-AMPsom kan attackeras av PPi • VRS katalyserar 32PPi utbyte i närvaro av threonin och bildar komplexet VRS•Thr-AMPi frånvaro av tRNA

34. ii) Argument för formation av VRS•Thr-AMPsamt hydrolysering av ”mischarged” Thr-tRNAVal: • I närvaro av tRNA och Thr verkar VRS som ett ATP fosfatase och hydrolyserar ATP → AMP + PPi och katalyserar inte en nettoformation av Thr-tRNAVal. Nettoreaktionen blir hydrolys av ATP → PPi + AMP • Under den här reaktionen formasintermediatetVRS•Thr-AMP (som visas genom 32PPi utbytesreaktionen) men även intermediatetThr-tRNAVal måste bildas och hydrolyseras

35. iii) Argument för formation av ”mischarge” Thr-tRNAVal • Transient ”mischarged” tRNAVal kan detekteras och isolerats Figur 7.7: Blanda VRS•(14C)Thr-AMP + tRNAVal → (14C)Thr-tRNAVal (transientlyformed) • (14C)Thr-tRNAVal kan isoleras genom fällning med fenol

36. iiii) Hydrolys av ”mischarge” Thr-tRNAValmhaVRS sker tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” Figur 7.8: (14C)Thr-tRNAVal + VRS → (14C)Thr + tRNAVal, k = 40 s-1

37. iiiii) Produktion av Thr-tRNAval är tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” Figur 7.9: VRS•Thr-32AMP + tRNAVal → VRS + Thr-tRNAVal + 32AMP, k = 36 s-1 Alltså är det följande reaktionsmekanism som gäller: