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AMP Aide Médicale à la Procréation. L.CHASSAGNE – 18 novembre 2010.
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AMP Aide Médicale à la Procréation L.CHASSAGNE – 18 novembre 2010
« l’assistance médicale à la procréation (AMP) s’entend des pratiques cliniques et biologiques permettant l’insémination artificielle et la conception in vitro , le transfert d’embryons ainsi que toute technique d’effet équivalent permettant la procréation en dehors du processus naturel. » Arrêté du 3 août 2010 relatif aux règles de bonnes pratiques cliniques et biologiques d’assistance médicale à la procréation.
L’infertilité L’infertilité est définie par l’OMS comme « l’incapacité d’un couple à parvenir à une conception et à mener à bien une grossesse à terme après un an ou plus de rapports sexuels réguliers et non protégés. » On estime que plus de 70 millions de couples à travers le monde sont infertiles. En France, aujourd’hui, 10 à 15 % des couples rencontrent des difficultés à concevoir et consultent pour infertilité
Quelques chiffres pour la France. 10 à 15 % des couples (500 000 couples consultent chaque année) 20 000 naissances par an : 2,4 % du total des naissances (agence de biomédecine 2006) 70 % par FIV (3 % avec donneur) et 30 % par insémination (9,5 % avec donneur) 200 000 enfants conçus par FIV depuis 30 ans (3 millions dans le monde)
Délais moyens pour concevoir un enfant • Près de 80 % des couples conçoivent naturellement un enfant au bout de 2 ans - La fertilité des femmes est à son maximum vers 20 ans, puis diminue lentement à partir de 30 ans jusqu’à 35 ans et beaucoup plus rapidement par la suite La probabilité d’avoir un enfant est : • - de 25 % par cycle à 25 ans • de 12 % à 35 ans • de 6 % à 40 ans • - La fertilité est presque nulle après 45 ans
Une première grossesse de plus en plus tard …. L’âge moyen de la première grossesse est passé de 24 ans en 1978, à 29 ans en 2007 et à 30 ans aujourd’hui. 28 000 femmes âgées de 40 ans environ ont accouché en 2007, alors qu’elles étaient 8000 en 1978 Le risque de faire une fausse coucheest de 15 à 20 % vers l’âge de 30 ans et de 40 % vers l’âge de 40 ans PS : une étude récente de l’INSERM montre que la densité de spermatozoïdes a chuté de moitié en un demi-siècle.
Règlementation en France • Loi de référence : Loi n° 94-654 du 29 juillet 1994 • LOI n° 2004-800 du 6 août 2004 relative à la bioéthique (Révision des Lois de Bioéthique (20 janvier 2010)) • Décret n° 2006-121 du 6 février 2006 relatif à la recherche sur l'embryon et sur les cellules embryonnaires • Décret n° 2006-1563 du 8 décembre 2006 fixant les conditions de saisine de l'agence de biomédecine (ABM) • Arrêté du 10 aout 2010 relatif aux règles de bonnes pratiques cliniques et biologiques d'assistance médicale à la procréation
Le prélèvement de sperme - Respect d’une abstinence sexuelle de 3 à 5 jours • Conditions d’antiseptie strictes (lavage des mains, de la verge et du gland ) accompagnement du patient et explications données de vive voix • prélèvement par masturbation dans un réceptacle stérile adapté (de préférence au laboratoire) • - récupération du prélèvement (information sur les problèmes éventuellement rencontrés) • Homogénéisation, recouvrement et mise à l’étuve à 37° C rapidement
Volume : • 1,5 – 6 ml reflet des capacités sécrétoires des glandes annexes • L'éjaculât se constitue de l'émission successive des sécrétions de la prostate, puis des épididymes et les déférentset enfin les vésicules séminales. • 20 % du volume de l'éjaculât provient des sécrétions prostatiques 20 % provient des épididymes et les déférents • 60 % du volume provient des vésicules séminales. La viscosité : le liquide séminal coagule rapidement après l'éjaculation puis il se liquéfie secondairement grâces aux enzymes prostatiques. (hyperviscosités : asthénozoospermie (b) et test de Hünher négatif)
Le pH : 7,2 - 8 • témoin indirect des sécrétions des glandes annexes • sécrétions prostatiques acides • sécrétions des vésicules séminales basiques • exemple : azoospermie à pH acide Un pH acide inférieur à 6,5 témoigne d'un défaut du fonctionnement des vésicules séminales (agénésie vesiculodéférentielle bilatérale) • Un pH > 8 : évoque une insuffisance prostatique ou une infection.
La numération :15 – 200 106 /ml ou ≥ 40 106 /éjaculat • La première partie de l'éjaculation qui est constituée des sécrétions prostatiques et épididymairescontient la plus grande partie des spermatozoïdes (jusqu'à 80 % de la totalité des spermatozoïdes contenus dans l'éjaculât) intérêt, d’une de fragmentation de l'éjaculât (premier jet concentré en spermatozoïdes) • Azoospermie :absence de spermatozoïdes à l'éjaculât • azoospermie sécrétoire [ou azoospermie non obstructive (ANO)] • altération de la spermatogenèse soit liée à une affection testiculaire primitive congénitale ou acquise , soit associée àuneinsuffisance hypothalamo-hypophysaire acquise ou congénitale.L'azoospermie est excrétoire [ou • azoospermie obstructive (AO)] • spermatogenèse conservée - obstacle au niveau des voies excrétoires (épididymes, canaux déférents, canaux éjaculateurs). Les lésions peuvent être acquises ou congénitales [comme l'absence bilatérale des canaux déférents (ABCD)].
Oligospermie (oligozoospermie) : < 15 106 /ml ou < 40 106 /éjaculat • Oligospermie sévère : < 5 106 /ml • Cryptozoospermie :(Crypto = caché ) • La cryptozoospermie est définie par l'absence de spermatozoïdes observé à l'examen microscopique direct d'une goutte de sperme mais à l'opposé de l'azoospermie, une recherche approfondie permet d'en retrouver quelques uns (moins de 100 000 spermatozoïdes dans la totalité de l'éjaculât). • cryptozoospermiesévère : < 10 000 spermatozoïdes dans l'éjaculât • cryptozoospermie modérée : entre 10 000 et moins de 100 000 spermatozoïdes dans l'éjaculât • Polyspermie ou polyzoospermie : ≥ 250 106 /ml
La mobilité : (a + b + c) ≥ 40 % ou (a + b) ≥ 30 % • La mobilité des spermatozoïdes est classée en trois catégories : • catégorie "a" : mobilité progressive et rapide (« fléchants ») • catégorie "b" : mobilité progressive mais lente • catégorie "c" : mobilité sur place. • catégorie « d » : spermatozoïdes immobiles • Asthénozoospermie : < 30 % spermatozoïdes à mobilité normale (catégories a+b) ou < 40 % des spermatozoïdes à mobilité de catégorie "a+b+c". • Asthénozoospermieprimaire : à la première heure après l'éjaculation : moins de 50 % de spermatozoïdes sont mobiles (mobilité totale) ou mobilité de spermatozoïdes progressifs < 25% • Asthénozoospermiesecondaire : à la quatrième heure après éjaculation : • Chute de mobilité >50 % comparativement à la première heure.
Immobilité totale des spermatozoïdes : • soit nécrozoospermietotale • Soit akinétozoospermie • spermatozoïdes immobiles mais vivants. Cette pathologie est due soit à une anomalie flagellaire, soit à la présence de spermatozoïdes immatures. Il existe plusieurs techniques au laboratoire pour tester la viabilité des spermatozoïdes : • - une coloration diagnostique à l’éosine nigrosine(Y-éosine) • - le test hypo-osmotique (HOST = Hypo-osmoticswelling test) : les spermatozoïdes immobiles mais vivant, quand ils sont placés dans le milieu hypo-osmotique, leur flagelle se courbe. • la pentoxifylline (PF) : elle permet de détecter rapidement les spermatozoïdes vivant en induisant leur mobilité.
La vitalité : ≥ 58 % coloration éosine / nigrosine • Nécrozoospermie: diminution du nombre de spermatozoïdes vivants dans l’éjaculat : il faut rechercher un problème infectieux ou oxydatif • La nécrozoospermie partielle : > 42 % des spermatozoïdes sont morts • La nécrozoospermie totale : pas de spermatozoïdes vivants dans l'ensemble de l'éjaculât.
La morphologie ou spermocytogramme : ≥ 30 % de formes typiques si classification de David modifiée ≥ 4 % de formes typiques si classification de Kruger
Les anomalies des spermatozoïdes sont classées en 4 catégories (selon David) : • - anomalies de la tête : • valeur normale : inférieure à 35 % ; • elles englobent : • spermatozoïdes microcéphales • spermatozoïdes macrocéphales • spermatozoïdes à tête allongée • spermatozoïdes à tête irrégulière • anomalie de la pièce intermédiaire : • c'est la présence de restes cytoplasmiques • valeur normale : inférieure à 20 % • anomalies du flagelle : • valeur normale : inférieure à 20 % • il s'agit de • spermatozoïdes à flagelle angulé • spermatozoïdes à flagelle enroulé • formes doublés : • valeur normale : inférieure à 10 %.
Grille de lecture Classification de David modifiée
Test de migration / survie des spermatozoïdes Ce test permet d’apprécier le comportement des spermatozoïdes dans les milieux de cultures destinés à l’AMP. Il assure une sélection des spermatozoïdes selon des critères comme la vitalité, la mobilité et la morphologie Le test de migration–survie des spermatozoïdes renseigne le clinicien et le biologiste quant au nombre et à la motilité des spermatozoïdes disponibles avant une assistance médicale à la procréation (AMP). Si ce test élimine les cellules porteuses de certaines anomalies affectant la pièce intermédiaire et/ou le flagelle, on note également une diminution du pourcentage d’acrosomes malformés après préparation. Il participe donc au choix de la technique à employer.
Test de migration / survie des spermatozoïdes Le principe est d’assurer une séparation des cellules en fonction de leur mobilité en leur faisant traverser des liquides de différentes densités et en centrifugeant. Les spermatozoïdes les plus mobiles traverseront facilement tous les obstacles rencontrés. Ils seront ensuite lavés avec un milieu de culture La technique de préparation (2 ou 3 couches de gradient)dépend de la qualité du sperme .Ces techniques ont toutes pour objectif de recueillir le maximum de spermatozoïdes de bonne qualité. La préparation reproduit les modifications subies lors d’un rapport sexuel, quand les spermatozoïdes traversent la glaire cervicale : - Séparation du plasma séminal et des spermatozoïdes - Élimination des débris cellulaires - Sélection des spermatozoïdes mobiles, normaux.
Autres explorations biologiques chez l’homme Biochimie du liquide séminal : Epididyme L-carnitine Vesiculesseminales Fructose Prostate ZINC, Ac. CITRIQUE, PHOSP. ACIDES
Tests immunologiques • Des tests permettant la mise en évidence des auto-anticorps dans le sperme et qui entraînent des altérations dans la mobilité des spermatozoïdes (agglutinations spontanées des spermatozoïdes) • Le Mar test :consiste à détecter des anticorps anti spermatozoïdes de type (IgA, IgG, IgM) fixés sur les spermatozoïdes. • Le test aux immuno-billes : consiste à détecter directement sur les spermatozoïdes et localiser la région sur laquelle les anticorps anti spermatozoïdes sont fixés. • Le dosage des anticorps anti spermatozoïdesdans le plasma séminal et la circulation sanguine.
Dosages hormonaux : - FSH, TESTOSTERONE (+/-LH) (intérêt dans les azoospermie et oligo sévères) FSH normale dans les azoospermies excretoires Microscopie électronique : étude ultrastructurale des spermatozoïdes indications limitées (akinétozoospermie…) Caryotype : doit être réalisée devant une azoospermie sécrétoire et une oligospermie sécrétoire sévère (< 5 millions spermatozoïdes/ml). Microdélétion du chromosomes Y : dans les zones (AZFa, AZFb et AZFc) du bras long du chromosome Y. Indications si < 1 106 /ml
Test post-coïtal de Hühner Il permet d'étudier la qualité de la glaire cervicale après un rapport sexuel ainsi que le comportement des spermatozoïdes. Test effectué en période pré-ovulatoire, les deux jours précédant la date prévue d'ovulation . Prélèvement réalisé entre 4 et 12 heures après un rapport sexuel. SCORE d’INSLER
L'index de fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes • L'index de fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes consiste à rechercher des fragments de l'ADN libérés par les spermatozoïdes au cours de leur évolution apoptosique. • Cette index est donné en poucentages : • Index inférieur à 13 % : bon pronostic pour le développement embryonnaire • Index évalué entre 14 et 29 % : pronostic résérvé pour le développement embryonnaire. Contrôle recommandé trois mois plus tard. • Index égale ou supérieur à 30 % : pronostic résérvé et défavrable pour le développement embryonnaire. • INDICATIONS • Tératozoospermieportant principalement sur la portion céphalique • Infertilité inexpliquée / FC à répétition / Varicocèle • En FIV : • Absence de clivage / Mauvaise qualité embryonnaire / Echec d'implantation.
IAC Insémination Avec gamètes du conjoint Après recueil par masturbation dans un réceptacle stérile, le sperme est préparé au laboratoire afin de reproduire les modifications subies lors d’un rapport sexuel, quand les spermatozoïdes traversent la glaire cervicale : séparation du plasma séminal et des spermatozoïdes élimination des débris cellulaires et autres cellules sélection des spermatozoïdes mobiles et normaux aptes à féconder. Les IAC représentent un coût financier non négligeable (environ 460 € /tentative). 6 tentatives sont prises en charge à 100% par la sécurité sociale dans le cadre du traitement de stérilité.
FIV conventionnelle La fécondation in vitro (FIV) reproduit au laboratoire la fécondation et les premières étapes du développement embryonnaire. Elle réalise le plus souvent pendant 2 ou 3 jours in vitro, hors de l’organisme, dans un milieu de culture approprié, ce qui se passe normalement dans la trompe : rencontre des ovocytes et spermatozoïdes (fécondation) et formation de l’embryon aux tous premiers stades du développement.
Mise en culture des embryons Le liquide folliculaire issus de la ponction est observé à la loupe binoculaire, au laboratoire, afin d’isoler les ovocytes, puis ces derniers sont placés au contact des spermatozoïdes, dans un milieu de culture spécifique.
Résultats centre d’AMP de Roanne
