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Rocio Inga Peña Dpto. Bioquímica, Biol Mol & Farmacología

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS. Rocio Inga Peña Dpto. Bioquímica, Biol Mol & Farmacología. Modificaciones: Glicosilación, fosforilación, adición de grupos prostéticos, etc…. Extracto crudo (mezcla de proteínas). Gel de apilamiento (menor concentración).

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Presentation Transcript

  1. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS Rocio Inga PeñaDpto. Bioquímica, Biol Mol & Farmacología

  2. Modificaciones: Glicosilación, fosforilación, adición de grupos prostéticos, etc…

  3. Extracto crudo(mezcla de proteínas)

  4. Gel de apilamiento (menor concentración) Gel de separación (la concentración depende de la resolución que se busque )

  5. Marcadores de Peso Molecular

  6. DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA Inicio de corrida(donde inicia el gel separador) Frente de corrida (línea donde termina el colorante)

  7. (RF) RF = distancia recorrida por la banda distancia total al frente de la corrida DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA

  8. REACTIVOS: • Acrilamida (C3H5NO) – formación de polímeros • Bisacrilamida (N,N’- methylenebisacrylamide (C7H10N2O2) - cross-linking entre las cadenas de polímeros • SDS : saturación con cargas negativas • APS y TEMED : catalizadores de la reacción de polimerización • DTT o βME : agentes denaturantes • Azul de Bromofenol: Permite la visualización de la corrida electroforética. Carga negativa por encima de pH 4.6.

  9. Tinción del Gel SDS-PAGE • La tinción con Azul de Coomassie ( Coomassie Brilliant Blue) puede detectar una banda de hasta 50 ng • La tinción con plata incrementa la sensibilidad de detección ( 50 veces aprox)

  10. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Separación por: • Punto isoeléctrico • Tamaño

  11. Separación por Punto Isoeléctrico

  12. Punto isoelectrico igual pero diferente tamaño Punto isoelectrico diferentepero del mismo tamaño

  13. Análisis de Proteínas Multiméricas - Se puede determinar el número y tamaño de subunidades mediante la electroforesis bajo condiciones denaturantes • Agentes denaturantes frecuentemente usados: • Dithiotreitol (DTT)- β-mercaptoetanol (βME)

  14. El Dithiothreitol (DTT) es un agente denaturante

  15. PRACTICA A REALIZAR • ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN UNA DIMENSION • CONDICIONES: • DENATURANTES (SDS, BME, alta temperatura)

  16. Las muestras para analizar serán diferentes fracciones obtenidas durante la purificación de la Pirazinamidasa: • Extracto crudo • Fracción con proteìna, sin actividad • Fracción con proteìna, con actividad

  17. Dos tipos de tratamiento de muestras: A) Denaturación directa de las muestras: • Mezclar 25 uL de la fracción + 15 uL de Loading Buffer (Buffer de carga) • Hervir por 4 - 5 minutos • Cargar 20-25 uL en el gel. B) Precipitación previa a denaturación - Se utilizará el protocolo de precipitación con Etanol (33%)

  18. Actividad enzimática Cantidad de Proteína (Pirazinamidasa) (Bradford)

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