Clonage Moléculaire - PowerPoint PPT Presentation

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  1. Clonage Moléculaire

  2. Définitions • Clonage : • Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale (Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN • Sous-clonage: • Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou une partie de ce dernier d’un vecteur à un autre vecteur • Plasmide recombinant: • Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit • Organisme recombinant • Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été introduit

  3. Pourquoi cloner? • Séparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spécifique d’ADN 3

  4. Étape 1- Séparer • Deux approches: • Fragmenter/digérer l’ADN génomique • Génère un très grand nombre de fragments • Peut-être difficile de retrouver le fragment d’intérêt • Amplification par PCR • Beaucoup moins de fragments • Beaucoup plus facile de retrouver la séquence d’intérêt

  5. Enzyme de restriction Enzyme de restriction Générer des extrémités compatibles Fragment d’intérêt Ligature d’ADN Vecteur approprié Ligature Intramoléculaire Non-Recombinant Ligature Intermoléculaire Recombinant Transformation Cellules Hôte CelluleRecombinante Cellule Non-Recombinante Cloner 1 plasmide/1 cellule

  6. Duplication de plasmide 1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert Croissance bactérienne Amplification des PlasmidesRecombinants

  7. Criblage et Identification de Clones Recombinants Plasmidiques • Cartographie de restriction • Hybridation • PCR

  8. Expression • Pourquoi? • Produire la protéine dans un système hétérologue • Produire la protéine en grande quantité • Purifier la protéine • Étudier l’activité de la protéine

  9. Amplification, Mutagenèse, Clonage & Expression de LacZ– Projet II • Partie I • Amplification & mutagenèse par PCR du gène LacZ • Partie II • Clonage de LacZ dans pUC19 • Partie III • Esai enzymatique des protéines recombinantes

  10. Purification & Digestion de l’ Amplicon Mel 1 • Purification par QiaQuick • Permet de retirer le tampon, sels, etc. • Permet de retirer les amorces • Permet de retirerl’enzyme • Digestion • Sites de restriction BamHI et EcoRIontétéajoutés à la séquence de l’amplicon • Absent dans la séquence de Mel 1 • Présentdans le site de clonage multiple du vecteurd’expression (pRS424) • Permet le clonagedirigé