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Les virus comme vecteurs thérapeutiques. Par Patrick Salmon chercheur au Département de Microbiologie et Médecine Moléculaire de l’Université de Genève. Thérapie génique: quelques applications. Parkinson, Huntington. Mucoviscidose. Hypercholestérolémie Hémophilie. Immunodéficiences

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Presentation Transcript
les virus comme vecteurs th rapeutiques
Les virus comme vecteurs thérapeutiques

Par Patrick Salmon

chercheur au Département de Microbiologie

et Médecine Moléculaire de l’Université de Genève

slide2

Thérapie génique: quelques applications

Parkinson,

Huntington

Mucoviscidose

Hypercholestérolémie

Hémophilie

Immunodéficiences

Anémies

Dystrophies

slide3

Questions à se poser lorsqu’on envisage

une thérapie génique

Ou…

WWW.genetherapy.com

slide4

WWW.genetherapy.com

What?

Where?

When?

slide5

WHAT? Quel produit le gène doit-il exprimer?

Quelle est la taille de sa séquence codante?

WHERE? Quelles sont les cellules à cibler?

WHEN? Combien de temps le transgène doit-il être exprimé?

Son expression doit-elle être régulée?

slide6

Maladies candidates pour la thérapie génique

MALADIE HEREDITAIRES

PathologieDéfaut génétiquePrévalenceCible thérapeutique

Immunodéficience ADA, X-SCID rare CSH ou lympho T

Hémophilie A facteur VIII 1: 10.000 mâles foie, muscle

Hémophilie B facteur IX 1: 30.000 mâles CSH, fibroblaste

Hyper-cholestérolémie récepteur LDL 1:1.000.000 foie

familiale

Mucoviscidose CFTR (transporteur 1:3.000 cauc. poumon

des ions chlores)

Hémoglobinopathies: globine 1:600 (éthnie!) CSH

anémie falciforme,

thalassémie

Maladie de Gaucher glucocérébrosidase 1:450 (éthnie!) CSH

Emphysème héréditaire a-1 antitrypsine 1:3.500 foie et poumon

slide7

Maladies candidates pour la thérapie génique

MALADIE ACQUISES

Pathologie Prévalence Cible thérapeutique

Cancer 1 million/an aux USA cellules cancéreuses ou dendritiques cellules présentatrices d'antigènes

maladies dégénératives:

Parkinson 1 million aux USA

Alzheimer 4 millions aux USA neurones, cellules gliales

désordres « immunologiques »:

diabète de type I dizaines de millions cellules b du pancréas, autres…

Cardiovasculaire:

resténose, ATS dizaines de millions cellules endothéliales vasculaires

maladies infectieuses:

SIDA, hépatite B ou C centaines de millions CSH, hépatocytes

slide8

Le vecteur idéal

      • Est défini par les exigences thérapeutiques
      • (expression stable ou transitoire).
      • Peut atteindre de hautes concentrations permettant l’infection
      • de nombreuses cellules.
      • Est aisément produit par des techniques reproductibles.
      • Pour l'expression à long terme, est intégré dans un site spécifique
      • du chromosome, ou persiste en épisome stable.
      • Possède une unité transcriptionelle contrôlable.
      • Cible certaines cellules spécifiquement.
      • Est dénué de composants induisant une réponse immunitaire.
      • MAIS: un vecteur moins-que-parfait sera souvent adéquat...
slide9

Thérapie génique: in ou ex?

Isolation

Vecteur

Cellules

Injection

Vecteur

Transplantation

Cellules

Génétiquement Modifiées

In vivo

Ex vivo

slide10

Vecteurs pour la thérapie génique

  • Viraux
  • adénovirus
  • virus adéno-associé (AAV)
  • rétrovirus: oncorétrovirus
  • lentivirus
  • virus herpes
  • virus à ARN (polio, sendaï, etc…)
  • Non viraux
  • ADN nu
  • liposomes
slide11

Vecteurs

viraux

slide12

Vecteurs

viraux

slide13

Adénovirus

Rétrovirus

AAV

Trois familles de virus utilisés pour le développement de vecteurs

slide14

Adénovirus

AAAH!

Grande capacité (30-40 kb)

Facile à produire à hauts titres

Infecte les cellules non-mitotiques

Non-enveloppé Génome: ADN

Taille: 70-90 nm

OOOOH…

Ne s’intègre pas

Immunogénique (moins si « éviscéré »)

Peut induire une « acute phase response »

slide15

AAV

AAAH!

Infecte les cellules non-mitotiques

LE VIRUS s’intègre à un site spécifique

Non-enveloppé Génome: ADN Taille: 20-30 nm

OOOOH…

Faible capacité (4 kb)

Difficulté de production (« dependovirus! »)

LE VECTEUR s’intègre au hasard

Immunogénicité conditionnée par la

contamination par le virus helper

slide16

Retrovirus

AAAH!

Capacité raisonnable (10 kb)

Facilité de production adéquate

Infecte les cellules non-mitotiques

(LENTIVIRUS)

S’intègre

Pas de transfert de séquences codantes virales

Enveloppé

Génome: ARN-ADN

Taille: 90-120 nm

OOOOH…

S’intègre au hasard

N’infecte pas les cellules non-mitotiques

(ONCORETROVIRUS)

slide18

Cycle de réplication du HIV

Fusion

Modifications

Post-traductionnelles

Synthèse

Proteines

decapsidation

Attachement

Maturation

Export

Nucléaire

Retro-

Transcription

Assemblage

bourgeonnement

Transcription

Import

Nucléaire

Intégration

CD4

CCR5

CXCR4

slide19

Transduction par vecteur lentiviral

Fusion / Décapsidation

Rétro-Transcription

Import Nucléaire

Attachement

Intégration

Expression

Endocytose

slide20

Quelques dates marquantes…

1996: Un vecteur lentiviral peut effectuer le transfert, l’intégration et l’expression à long terme un gène dans les neurones in vivo.

1998: Transduction stable de CSH humaines capables de reconstituer des souris NOD/SCID.

2000: Traitement de la mucopolysacharidose, du Parkinson et de la thalassemie dans des rongeurs.

2002: transgenèse avec vecteur lentiviral.

2003: Premier essai clinique avec un vecteur lentiviral.

slide21

polyA

polyA

polyA

polyA

NEF

VPR

VPU

GAG

VIF

POL

LTR

Génome HIV-1

LTR

T

A

T

R

E

V

Plasmides d’empaquetage lentivecteurs:

NEF

VPR

VPU

GAG

VIF

1e génération

CMV

POL

T

A

T

R

E

V

GAG

CMV

POL

2e génération

T

A

T

R

E

V

GAG

CMV

POL

3e génération

RSV

REV

slide22

Vecteur de transfert

vpu

nef

gag

vif

RRE

env

vpr

tat

rev

pol

cPPT

Y

LTR

LTR

dPPT

rev

éléments actifs en cis

LTR

LTR

RRE

dPPT

Y

cPPT

SA

SD

Capacité: 10 kb

slide23

Prototypes de lentivecteurs

SIN

SIN

SIN

SIN

WPRE

WPRE

WPRE

WPRE

SIN

SIN

SIN

SIN

SIN

SIN

RRE

cPPT

Y

Ubiquiste

EF1-a

Gene X

RRE

cPPT

Spécifique

Y

gp91phox

Gene X

RRE

cPPT

Inductible

Y

Tet-O

Gene X

RRE

cPPT

Y

Bicistronique

Gene X

Gene Y

RRE

cPPT

Y

Inhibiteur

Gene X

sihRNA

sihRNA

U6

U6

slide24

RRE

cPPT

Y

Gene X

LTR

LTR

WPRE

Production de lentivecteurs

GAG

POL

CMV

An

REV

RSV

An

293T

VSV G

CMV

An

50 TU/cellule x jour

slide25

Lignée stable productrice de lentivecteurs

RRE

cPPT

Y

Gene X

LTR

LTR

WPRE

GAG

POL

CMV

An

REV

Tet

An

VSV G

Tet

An

Dox

30 TU/cellule x jour

slide26

Titration d’un vecteur lentiviral

  • Titration provirale:
  • real time QPCR
  • 2. Expression du trangène:
  • FACS, etc…
  • Décompte des particules:
  • p24-CA
  • Décompte des génomes:
  • real-time QPCR
slide28

Hepatocytes comme cibles de thérapie génique

Pour le traitement de maladies hépatiques

Crigler-Najjar type I (Bilirubine UDP-Glucuronosyl transferase)

Tyrosinémie héréditaire type I (Fumaryl acetoacetate hydrolase)

Hyperammoniémie (Ornithine transcarbamylase)

Maladie de Wilson (ATP 7B)

Hépatite viral B ou C (Immunisation intracellulaire)

Comme site de production de protéines systémiques

Maladies génétiques hépatiques

Emphysème (alpha-1 Antitrypsine)

Hémophilie A,B (Facteur VIII, Facteur IX)

Trouble du métabolisme lipidique (Apolipoprotéines)

Maladies génétiques non-hépatiques

Diabète type I (Insulin, PDX-I)

Mucopolysaccharidose (alpha-L-Iduronidase)

Thalassémie (Erythropoiétine)

slide29

Hypercholestérolémie homozygote familiale

(récepteur low-density lipoproteins -LDL-)

Réimplantation

Récolte

Transfert de gène

Culture

Purification des hépatocytes

Lobectomie

20%

slide30

Gfp-LV, moi 10, with vit E

2x107 hep.

50% hepatectomy

1%

1%

5 wks

2 wks

70% hepatectomy

x100

x100

x200

x200

FL2

31%

0.02%

GFP

slide31

Précurseur myeloide

Migration

(transdifferenciation?)

Neutrophiles, monocytes

CSH

Précurseur Lymphoide

Lymphocytes

Précurseur érythroide

Erythrocytes

slide32

Précurseur myéloide

Neutrophiles, monocytes

IL-7

IL-15

IL-7

IL-15

IL-7

CSH

Précurseur lymphoide

Lymphocytes T

Précurseur érythroide

Erythrocytes

slide33

Il-7 et homéostase des lymphocytes T

Y

JAK1

Y

P

P

IL-7

IL-7Ra

gc

JAK3

PI3-K

STAT5a

Bad

P-Bad

STAT3

STAT5b

Bcl-2

Bcl-X

Cyt C

Anti-apoptose

Pro-differenciation

slide34

X-SCID

IL-7

IL-7

IL-15

Lymphocytes T

IL-15

IL-7

CSH

Précurseur lymphoide

slide35

Chaîne g ILR

LTR

LTR

Thérapie génique des « enfants bulles »

Isolation des CSH

Transduction

Transplantation

CSH

Génétiquement Modifiées

slide36

Chaîne g ILR

LTR

LTR

Thérapie génique X-SCID

Vecteur: MLV (oncorétrovirus)

Cibles: ~ 2x108 cellules CD34+ activées

Efficacité de transduction: ~ 30%

Fraction de cellules sanguines positives pour le transgène:

- lymphocytes T: ~ 100%

- neutrophiles: ~ 0.1%

slide40

Promoteur

Transgène

LTR

LTR

Oncogenèse par intégration

Oncogène

Effet “enhancer”

Effet promoteur

Oncogène

slide41

Chaîne g ILR

LTR

LTR

Leucémie post-thérapie génique X-SCID

Exon 5

Exon 4

Promoteur LMO2

Exon 1

Exon 3

Exon 2

slide42

IL-15

IL-7

IL-7

IL-7

IL-15

IL-7

IL-7

IL-15

slide43

Thérapie génique X-SCID

11 enfants traités

1 sans réponse

2 leucémies (1 rémission, 1 rechute)

8 à la maison avec une vie normale

slide44

Thérapie génique SCID-ADA

4 enfants traités

4 enfants guéris

slide46

Quelques axes de recherche en thérapie génique

  • vectorologie (ex: ciblage)
  • toxicologie (ex: oncogenèse)
  • immunologie (ex: tolérization)
  • développement de modèles
slide47

Exon 3

Exon 4

Promoteur

Exon 1

Exon 2

Intégration des vecteurs rétroviraux

HIV

MLV

slide48

Exon 3

Exon 4

Promoteur

Exon 1

Exon 2

Intégration ciblée