EVALUAREA STABILITĂŢII HORMONULUI DE CREŞTERE PRIN SDS-PAGE

1. EVALUAREA STABILITĂŢII HORMONULUI DE CREŞTERE PRIN SDS-PAGE Raul Nicoară1, Elena Dinte2, Alina Uifălean1, Maria Ilieş1, Simona Codruţa Hegheş1, Cristina Iuga1* 1Disciplina Analiza medicamentului, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicina și Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca, Romania. 2Disciplina Tehnologie farmaceutică şi biofarmacie, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca, Romania. *Autor corespondent: iugac@umfcluj.ro Hormonul de creştere este un hormon de natură proteică constituit dintr-un singur lanț de 191 de aminoacizi cu o greutate moleculară de 22191.45 Da. cu rol în stimularea creşterii, reproducerii şi regenerării celulare. Studii clinice recente indică o reepitelizare mai rapidă şi un timp de vindecare mai scăzut în urma administrării acestuia în cazul pacienţilor ce prezintă plăgi arse(1). Obiective Utilizând tehnica SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) s-a urmărit studiul stabilității rcGH (recombinant chicken growth hormone) ca atare. Acest deziderat s-a realizat prin monitorizarea și cuantificarea apariţiei de benzi proteice suplimentare cu mase moleculare mai mici 22kDa corespunzătoare produşilor de degradare formaţi în condiţiile descrise de ghidurile ICH Q1A și Q1B. Material şi metodă Condiţii electroforetice Gel discontinuu (5-15%) Voltaj aplicat: 100V – gel de concentrare, 200V – gel de separare Colorare: Silver staining Cuantificare: densitofotometrie Condiții cromatografice Faza mobilă: A: 0.1% acid trifloracetic în apă B: 0.1% acid trifloracetic în acetonitril Coloană: Hypersil BioBasic 4 150 mm x 4.6 mm Detecție: flourimetrică λexcitație=280 nm λemisie=300 nm Tipul separării: Gradient Materiale Soluție stoc rcGH 1.026 µg/µL reconstituită în NaHCO3 0.4% pH=8.4 Marker proteic Precision Plus Protein Standards Unstained (Bio-Rad) Condițiile studiilor de stabilitate conform ghidului ICH Q1A • Pregătirea probelor în vederea analizei • diluţie 1:1 cu tampon Laemmli • denaturare 5 minute la t=95°C • centrifugare 5 minte la 6000 rotații/minut Rezultate Figura 3. Studiul de stabilitate pe termen lung; linia 1 – standard proteic, liniile 2-8 probă rcGH Studiul stabilității pe termen lung (t=0-7-14-19-21-30 zile) a demonstrat stabilitatea rcGH (95,5% din concentraţia iniţială) pe perioada evaluată. Figura . Studiul de stabilitate pe pe termen scurt în prezența radiațiilor UV; linia 1 – standard proteic, liniile 2-8 probă rcGH Figura 2. Studiul de stabilitate pe termen scurt în absența luminii; linia 1 – standard proteic, liniile 2-8 proba rcGH A Figura 4. Cromatograma rcGH (tR=37.31 min) degradat 1h după expunere UV şi nedegradat (B) În urma studiilor de stabilitate pe termen scurtse constată că rcGH este stabil pe o perioadă de 5 zile în prezența luminii, degradându-se aproximativ 10%. În cazul expunerii la radiația UV, Fig.1. (t= 0-15-30-60-90-120-360 minute) în 6 ore se evidenţiază degradarea totală. În absența luminii Fig.2 (0-2-4-5-6-7-8 zile) după 6 zile se degradează 10% din concentrația inițială de rcHG semn că în aceste condiții stabilitatea este mai crescută. B Evaluarea cromatografică a probelor de rcGH a confirmat rezultatele obținute prin SDS-PAGE. Concluzii Evaluarea stabilităţii pe termen scurt a evidenţiat o degradare rapidă, în primele cinci zile degradându-se aproximativ 10% din concentrația inițială de rezultând numeroși produși de degradare în special în prezența luminii. Factorul cel mai important în degradarea rcGH s-a dovedit a fi radiația UV, în urma expunerii la cantitatea de radiații specificată în ghidul ICH Q1B acesta s-a degradat total doar 6 ore. Studiul stabilităţii pe termen lung, a arătat că rcGH este pe toată durata supusă evaluarii. Astfel, în vederea depozitării și păstrării preparate conținând rcGH se recomandă absența luminii și o temperatură de 5ᵒC ± 3ᵒC. Bibliografie (1) Breederveld RS, Tuinebreijer WE. Recombinant human growth hormone for treating burns and donor sites. Cochrane Database of Systematic Reviews 2012, Issue 12