1 / 27

A humán genom projekt 2.

Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária. A humán genom projekt 2. A “hasznos információ” - hány génünk van?. Kb. 40,000 - 60,000 fehérje kódoló gén (sokkal kevesebb, mint amennyit vártunk). vagyis a gének a genom kevesebb mint 5%-át foglalják el…. Hogyan találjuk meg a géneket?.

alexa
Download Presentation

A humán genom projekt 2.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária A humán genom projekt 2.

  2. A “hasznos információ” - hány génünk van? Kb. 40,000 - 60,000 fehérje kódoló gén (sokkal kevesebb, mint amennyit vártunk) vagyis a gének a genom kevesebb mint 5%-át foglalják el….. Hogyan találjuk meg a géneket?

  3. Gén = az az információ, amely az egyes szövetekben kifejeződik (expresszálódik) Rövid másolatok (150 -400 bp) PCR reakcióval: Kiindulási pont: Az agy (és más szövetek) mRNS információtartalma (cDNS) Craig Venter Random primer

  4. Olyan rövid DNS szekvencia részletek, melyek kifejeződnek (az agyban ill. máshol) EST könyvtár EST = expressed sequence tag Az agyban (ill. más szövetekben) kifejeződő gének azonosítására alkalmas

  5. 1. EST -k szekvenálása 2. Hol van az EST a humán genomban? ‘in silico’ keresés BLAST – Basic Local Alignment Search Tool 3. Gének azonosítása, új gének felfedezése 2375 agyi EST szekvenálása + BLAST < 400 ismert gén Közel 2000 új gén felfedezése

  6. Celera, 2001: kb. 30 000 EST kb. 35 000 humán gén A gének könyve

  7. Gének azonosítása ‘in silico’ Mi jellemző a génre: 1. Start jel (start kodon) 2. Stop jel (stop kodonok) NE LEGYENEK SŰRŰN! 3. Exon/intron átmenet: jellemző szekvenciák Kereső programok pl. ORF (NBCI)

  8. 4 5 6 ORF= open reading frame =„Olvasási keret” 1 2 3 GTGCGTGAGC GTGGCCACCG AGCGCGCCCT GCAGACGCCC ACCAACTCCT TCATCGTGAG CCTGGCGGCC GCCGACCTCC TCCTCGCTCT CCTGGTGCTG CCGCTCTTCG TCTACTCCGA GGTGAGCCGC GTCCGGCCGC ACGAGCATCC TCACCTGCTC

  9. NCBI ORF finder: „Olvasási keret kereső” http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html

  10. GT GC TATA ... Y C C A T A T F TATA-box:TATA A TATA Sp1 GC-box:GGGGCGGGG Zn2+ GC GT/CACC-box:GGTGTGGG GT L H H ... Transzkripciós faktorok 5’ nem kódoló régió 1 kódoló régió promoter DNS DNS-dep. RNS-pol. II. Transzkr. F. (FEHÉRJÉK) enhancer / silencer szekvenciák

  11. DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálat Gél retardáció Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

  12. EMSA Szabad DNS darab (jelölt oligo) * * DNS-fehérje komplex Hagyományos elektroforézis START

  13. EMSA * DNS-fehérje komplex Kapilláris elektroforézis Szabad DNS darab (jelölt oligo) * gyorsabb lassabb 0 2 4 6 8 perc

  14. Specifikus-e a DNS-fehérje kötődés ? Kompetíciós (versengési) kísérletek A jelölt oligo a „próba” „vad típusú próba” 5’– –CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’ 3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’ F „specifikus kompetitor” 5’–CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’ 3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’ A nem jelölt oligo a „kompetitor” „nem-specifikus (mutáns) kompetitor” 5’–CCCTTGGTGGGTTGGGGGCCTAAGCTGCG–3’ 3’–GGGAACCACCCAACCCCGGGATTCGACGC–5’

  15. EMSA: A specifikus kötődés igazolása 1 2 3 + + Nem spec. komp. Spec. Komp. DNS- fehérje komplex látjuk nem látjuk 2 3

  16. EMSA: A specifikus kötődés igazolása: supershift 1 2 3 + + Spec. ellenanyag + Spec. ellenanyag antipeptid DNS- fehérje komplex + * még lassabb „supershift” 3 2

  17. Rekombiáns DNS technológia a gyógyszeriparban Humán rekombináns fehérjék előállítása gyógyászati célra

  18. tPA trombózis hemofilia VIII. faktor immundeficiencia CSF (colony stimulatong factor) anemia eritropoetin hGF hiány (növekedési rendellenesség) hGF (growth factor) diabetes inzulin immunodeficiencia interleukin Pl. hepatitis B VACCINÁK FEHÉRJÉK ipari előállítása ? Rekombináns gyógyszerek

  19. Expressziós vektorok - csak exonok (cDNS) - bakteriális promoter - bakteriális riboszóma kötőhely Az idegen fehérje expressziójának ki/be kapcsolása lac operátor lac promoter Humán fehérje cDNS ProK DNS Represszor fehérje +IPTG indukció expresszió Humán génexpresszió Prokariótákban A humán gén “háziasítása”

  20. 1. Vektor konstrukció operátor lacZ (b gal) promoter Mesterséges “ inzulin gén” AmpR Inzulin A vagy B lánc (inszert) Aminósav szekvencia  bázisszekvencia ori Inzulin: Az első engedélyezett rekombináns gyógyszer

  21. 2. Bakteriális transzformáció, AmpR klónok szelektásása és klónozása E. coli plazmid AmpR lac represszor Bakteriális kromoszóma bgal inzulin 3. Fúziós fehérje termelése IPTG adásra 4. Lízis, fehérje izolálása, tisztítása 5. CN Br kezelés: Metionin lebomlik, inzulin felszabadul 6. A és B lánc in vitro egyesítése

  22. 1. Vektor konstrukció hGH Bakteriális szignál szekvencia (extracelluláris) AmpR Met-hiányos hGH bakteriális expressziója 1. Transzformáció szelekció növesztés 2. hGH szekréció a periplazmás térbe 3. Bakteriális periplazmás proteáz: levágja a szignál szekvenciát 4. Met-nélküli rec hGH tisztítása

  23. EuK sejt Virus-vektor-riporter gén konstruktum sejtmag Expresszió mérés a riporter fehérje alapján Riporter rendszerek • luciferáz ATP  ADP + Pi + fény • b-galaktozidáz Laktóz analóg  kék színű termék KÉK SEJTEK Riporter gének • CAT (kloramfenikol acetil transzferáz)

  24. Riporter gének felhasználása pl. Transzkripciós faktorok (TF) tesztelése 2 3 riporter 1 1: enhancer 2: promoter 3: TF génje B vektor A vektor EuK sejt sejtmag TF

  25. megtermékenyített petesejt csipesz vákum Transzgenikus állatok 1982: az óriás egér Növekedési hormon gén injektálása a hím pronukleuszba

  26. A transzgenikus állatok elkészítése 1. Mikroinjektálás (több száz petesejt, mikromanipulátor) 2. Beültetés ál-terhes nősténybe 3. Az utódok ellenőrzése (PCR a farokból) 4. Pároztatás 5. Beltenyésztés - Klónozás?

  27. A transzgenikus állatok klónozása A t-PA-t tejelő egér t-PA + lactalbumin szignál szekvencia szövet specifikus promoter szekréció a tejbe: 0.1 mg t-PA/ml tej Jövő: transzgenikus tehén? (JUH, KECSKE) Molecular Farming

More Related