Digesti n de dna usando enzimas de restricci n
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Digestión de DNA usando Enzimas de Restricción. Biol 3051L. Objetivos. El cortar el DNA con enzimas de restricción es muchas veces el primer paso de los investigadores para estudiar un gen. En este laboratorio se hará lo siguiente: Exponer al estudiante a tecnología actual.

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Objetivos
Objetivos

El cortar el DNA con enzimas de restricción es muchas veces el primer paso de los investigadores para estudiar un gen. En este laboratorio se hará lo siguiente:

  • Exponer al estudiante a tecnología actual.

  • Usar enzimas de restricción para cortar el DNA.

  • Separar los fragmentos usando electroforésis.

  • Analizarán un gel con DNA cortado con diferentes enzimas de restricción.


Restricci n de dna
Restricción de DNA

  • En bacterias, un plásmido, una pieza circular de DNA, constituye una gran parte del material genético.

  • El plásmido tiene que hacerse linear para poder recombinarse. Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas en el DNA.


Lambda dna
Lambda DNA:

  • Un vector ampliamente usado para crear DNA recombinante.

  • 48,502 pares de bases de longitud.

  • Usualmente un DNA recombinante de lambda tiene 80% DNA del vector y 20% del DNA insertado.


Enzimas de restricci n
Enzimas de restricción

  • También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a partir de ua secuencia que reconocen.

  • La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas direcciones).

  • Son extraídas de bacterias, donde actuan como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula.

  • Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII y EcoRI, toman el nombre de las bacterias que la producen:

    • EcoRI: E = género Escherichia.

      co = especie coli

      R = cepa RV 13

      I = primera endonucleasa aislada de esta cepa


Las enzimas de restricci n al cortar dna pueden producir dos tipos de cortes
Las enzimas de restricción al cortar DNA pueden producir dos tipos de cortes:

  • Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes.

  • Abruptos: cortan en un sólo punto.


Corte cohesivo con ecori
Corte cohesivo con EcoRI: dos tipos de cortes:


Electroforesis de dna
Electroforesis de DNA: dos tipos de cortes:

  • Después de tratar el lambda DNA con las diferentes enzimas, los fragmentos son separados por su tamaño usando un gel de electroforesis.

  • Luego de que la gel se “corre” el DNA se tiñe para revelar los patrones de bandas formados en el gel que corresponden a fragmentos de diferentes tamaños.


Principios de electroforesis
Principios de electroforesis dos tipos de cortes:

  • Técnica usada para separar y purificar macromoléculas (i.e. proteinas, ácidos nucleicos) que varían en tamaño, carga o conformación.

  • Cuando moléculas cargadas son colocadas en un campo eléctrico, estas migran hacia el polo positivo (ánodo) o polo negativo (cátodo) de acuerdo a su carga.


Geles com nmente usados
Geles comúnmente usados: dos tipos de cortes:

  • Agarosa: polisacárido extraido de algas. No tóxico. Poco poder de resolución pero alto grado de separación. Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb.

  • Poliacrilamida: polímero de acrilamida. Tóxico. Menor grado de separación pero alto poder de resolución. Usado para fragmentos de DNA de 500 pb. Usado para separar mezclas de proteínas.


Preparaci n de gel
Preparación de gel: dos tipos de cortes:

  • La mezcla de agarosa y buffer tiene que ponerse a calentar, agitando frecuentemente hasta que llegue al punto donde comience a hervir.


Digesti n de dna usando enzimas de restricci n


Pr ctica de uso de micropipetas
Práctica de uso de micropipetas: quemarse, vertir con cuidado la mezcla en la bandeja.

  • Apoye brazo que esté agarrando micropipeta en superficie firme.

  • Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta

  • Introduzca punta de micropipeta dentro de fosa, sin tocar el gel

  • Vierta el contenido en fosa, presionando botón de la pipeta hasta primer punto de resistencia


Digesti n de dna usando enzimas de restricci n


Digesti n de dna usando enzimas de restricci n

Resultados luego de teñir: