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  1. Imobilização de Enzimas JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008

  2. Imobilização de Enzimas O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo.

  3. Imobilização de Enzimas • Os processos de bioconversão enzimática têm sido bastante utilizados na produção, transformação e valorização de matérias-primas. Reações Enzimáticas Reatores Batelada Custos operacionais Baixa Produtividade Problemas de Remoção da E Variação na Qualidade dos Produtos Desvantagens

  4. Imobilização de Enzimas • Visando a obtenção de reações com: • > uniformidade tecnológica • viabilidade econômica, Utilização de Enzimas na Forma Imobilizadas

  5. Enzimas Livres x Imobilizadas • Livres • Instabilidade • Rápida perda da atividade catalítica • Não regeneração • Imobilizadas • Reutilização • Maior estabilidade (Faixas mais amplas de pH e Temp.) • Menor interferência de inibidores e/ou ativadores

  6. Métodos de Imobilização • Existem duas principais técnicas: • Modificação química da molécula: • + Substrato não sofre impedimento estérico pela matriz • - Pode ocorrer ligação através do sítio ativo tornando-se inativa • Ligação física da enzima em uma matriz inerte: • + Maior velocidade de reação e facilidade no preparo • - Impedimento estérico da molécula de substrato

  7. Métodos para Imobilização de Enzimas Ligação em Suportes Sólidos Confinamento Matriz Cápsula Microcápsula - Adsorção (carvão ativo) - Ligação Covalente (celulose, sílica) - Ligação Iônica (celulose) Métodos de Imobilização

  8. Métodos de Imobilização • 1. Imobilização por inclusão (Confinamento): • Retidas na rede tridimensional de um polímero insolúvel na água; • Aprisionadas no interior de cápsulas ou microcápsulas delimitadas por uma membrana semipermeável; • Não é estabelecida ligação química ao suporte e conserva a sua integridade molecular. • 1.1 Inclusão em uma matriz; • 1.2 Encapsulação; • 1.3 Microencapsulação.

  9. Métodos de Imobilização • 1.1 Inclusão em uma matriz; Em linhas gerais consiste no aprisionamento das moléculas de enzimas entre as malhas de um polímero geliforme.

  10. Métodos de Imobilização • 1. 1.1 Inclusão em uma matriz; • Simples ligação física entre enzima e suporte; • Nesse caso não há risco de desnaturação, pois não são empregados reagentes químicos, • As limitações difusionais são intensas.

  11. Métodos de Imobilização • 1. 1.1 Inclusão em uma matriz; • Matriz • Polímeros sintéticos • Silicone, Poliuretano, Nylon,… • Polissacarídeos • Alginato, Quitosana, Pectina,… • Proteínas • Colágeno, Gelatina Albumina,…

  12. E E E E E E Métodos de Imobilização • 1.2 Encapsulamento: • A enzima é imobilizada no interior de esferas, cujo envoltório é constituído por um polímero geliforme e semipermeável.

  13. E E E E Métodos de Imobilização • 1.2 Encapsulamento: Solução aq. contendo íon bivalentes (Ca2+) Enzima em uma solução aq.de Na Gotejada Forma-se uma esfera, dentro da qual as E ficam retidas (membrana = polímero de alginato de Ca) Quando a gota de alginato de Na entra em contato com a sol. salina

  14. Métodos de Imobilização • 1.3 Microencapsulamento • Consiste na preparação de um sist. emulsionado, onde a enz. está confinada no interior das micelas. • Não se pode encapsular enz. que destruam a matriz polimérica. • Enz. hidrolíticas não são adequadas para o encapsulamento, pois seu substrato de interesse geralmente é de alto peso molecular. • Polimerização provoca desativação da enzima

  15. Métodos de Imobilização • 1.3 Microencapsulamento Solução aq. de enzima Hexametilenodiamina Cl. de sebacila Fase orgânica Emulsificante Resultante da polimerização da diamina com cl. de sebacila Obtém-se as gotículas da solução enzimática envolvidas por uma película semi-permeável

  16. Métodos de Imobilização • 1.3 Microencapsulamento

  17. Métodos de Imobilização • Vantagens e incovenientes dos métodos de inclusão: • Convêm a quase todos os tipos de enzimas; • Restrição pelos fenômenos de impedimento estérico e de difusão através do gel ou da membrana.

  18. Métodos de Imobilização • 2. Fixação das enzimas sobre suporte sólido: • A enzima deve ser fixar tão solidamente quanto possível; • Bentonita: Insolúvel em água, mas uma vez hidratada intumesce e abre-se como uma espoja altamente porosa e carregada magnéticamente. • 2.1 Fixação por adsorção • 2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes

  19. Imobilização de Enzimas • 2.1. Adsorção • Consiste da união entre a enz. e um suporte inerte através de interações iônicas, adsorção física, ligações hidrofóbicas e forças atrativas de Van der Waals. • Suportes: Derivados da DEAE-celulose, Dowex Orgânicos Inorgânicos Celite, bentonita e alumina

  20. Métodos de Imobilização • 2.1 Fixação por adsorção • Trata-se de um método simples, de aplicabilidade generalizada. • Efetua-se por simples mistura da enz. com o suporte, mas condições de pH e força iônica adequados, em seguida lava-se a enz. que não ficou ligada. • Suportes: Carvão ativado, óxidos metálicos, vidros, resinas poliméricas.

  21. Métodos de Imobilização • 2.1 Fixação por adsorção • Diferentes parâmetros vão influenciar na quantidade de enz. fixada e solidaridade das ligações: • Do pH do meio dependem o número e a natureza das cargas sustentadas pelo suporte. • Sais em [ ] aumentam a solubilidade das enz. • Com da T existe a probabilidade de se aumentar a criação de ligações

  22. Métodos de Imobilização • 2.1 Fixação por adsorção • Vantagens: • Procedimento extremamente simples custos • Ligação ocorre por simples exposição e as condições são brandas • Os efeitos difusionais são despresíveis • Desvantagens: • Enz. são altamente dependentes de pH, solventes, substrato e Temp. • Podem ser facilmente dessorvidas com a alteração destes parâmetros * É uma das técnicas mais usadas.

  23. Métodos de Imobilização • 2.2 Fixação por formação de ligações covalentes • A enz. é ligada ao suporte inerte mediante ligações químicas covalentes, que são, normalmente, estabelecidas entre os aminogrupos primários e o anel fenólico dos aa constituintes da enz. com os grupos reativos do suporte (-CHO;-NCS, dentre outros).

  24. Métodos de Imobilização • 2.2 Fixação por formação de ligações covalentes • Em geral, as reações são feitas em meio aquoso, à Temp. entre 0°C e 25°C e o pH próximo à neutralidade • A escolha das condições irá depender da estabilidade da enz. e do suporte frente ao pH de formação das ligações covalentes, assim como a estabilidade das ligações suporte-enzima frente ao pH de utilização do sistema imobilizado.

  25. Métodos de Imobilização • 2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes • Vantagens: • Maior eficiência e estabilidade. • Não são tão suscetíveis a pH, força iônica, solventes e Temp. • Os suportes são escolhidos por suas propriedades de solubilidade, grupos funcionais, estabilidade mecânica, área superficial, intumescimento e natureza hidrofílica ou hidrofóbica. • Suportes: inorgânicos, polímeros naturais e sintéticos.

  26. Métodos de Imobilização • 2.2 Fixação das enzimas por ligações covalentes • Suportes: • Vidro; • Sílica; • Sephadex; • Celulose; • Nylon; • Poliestireno.

  27. Imobilização de Enzimas • Efeitos causados pela imobilização • Ao se agregar uma E a um material inerte, por mais suave que seja o procedimento, é razoável esperar algum tipo de efeito sobre sua atividade catalítica.

  28. Imobilização de Enzimas • Efeitos causados pela imobilização

  29. Imobilização de Enzimas • Interferência da imobilização sobre a atividade catalítica da E. Tabela 3. Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase nas formas solúvel e insolúvel

  30. Imobilização de Enzimas • Interferência da imobilização sobre a atividade catalítica da E. Tabela 3. Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase nas formas solúvel e insolúvel

  31. Imobilização de Enzimas • Interferência da imobilização sobre a atividade catalítica da E. Tabela 3. Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase nas formas solúvel e insolúvel

  32. Imobilização de Enzimas • Dentre os vários efeitos que a imobilização pode causar salienta-se: • Modificação da estrutura tridimensional • Efeitos estéricos e de conformação • Efeitos de Microambiente • Efeitos difusionais • Resistência difusionais externas • Efeitos difusionais internos

  33. Imobilização de Enzimas • Efeitos estéricos e de conformação • Quando a enz. é ligada ao suporte, pode sofrer alguma mudança na conformação, o que poderá abalar sua eficiência catalítica. • O processo de interação enz. suporte é quase sempre aleatório, poderá suceder que a região do sitio ativo se torne menos acessível ao substrato (impedimento estérico).

  34. Imobilização de Enzimas • Efeitos de microambiente • Quando a E é ligada a um suporte inerte, ela vai ficar sujeita a uma circunvizinhança algo ≠ do que quando esta livre. Esse fato poderá se refletir sobre os valores dos parâmetros cinéticos. • Os efeitos da circunvizinhança, que dependem da natureza física e química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do substrato, produto e cofatores entre a região vizinha do sist. imobilizado e o resto da solução.

  35. Imobilização de Enzimas • Efeitos de microambiente • O comportamento cinético de uma enzima presa a um suporte carregado pode diferir daquela apresentado pela enzima livre.

  36. Imobilização de Enzimas • Efeitos Difusionais • Quando a E é imobilizada sobre ou dentro de um suporte sólido, o substrato deve se difundir do seio da solução até o sitio ativo da E. • Se a velocidade de difusão do substrato é < que a veloc. de transformação pela E = a veloc. observada é mais baixa do que a esperada, visto que nem todas as moléculas de E estarão em contato com o substrato, (atingem a saturação).

  37. Imobilização de Enzimas • Efeitos Difusionais • Resistência difusionais externas • Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio da solução até a superfície de catálise • Efeitos difusionais internos • Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio catalítico poroso

  38. Propriedades de Enzimas Imobilizadas • Medida da atividade: • Atividade residual de E imobilizada é mais fraca que a das E nativa, mas a estabilidade é maior • Influencia das condições operacionais: • pH e T  desnaturação parcial ou total da proteína; • Imobilizada  resistem melhor a variações de pH e tratamentos térmicos;

  39. Imobilização de Enzimas • Vantagens • As enzimas podem ser reutilizadas • Os processos químicos podem ser continuamente operados e prontamente controlados • Os produtos podem ser facilmente separados • Os problemas de efluentes são minimizados • A repetibilidade do processo pode ser aumentada • estabilidade • custos

  40. Imobilização de Enzimas • Desvantagens • Aleatoridade da interação enzima-substrato; • Inexistência de um método geral de imobilizacao; • Atividade catalítica devido a efeitos: Microambiente Difusionais Estéricos / Conformacionais

  41. Imobilização de Enzimas • Tipos de Suporte • Existem inúmeros materiais inertes que podem ser usados. • A natureza física desses suportes pode variar, desde materiais geliformes até superfícies sólidas (pérolas de vidros) recobertas com alguma substância capaz de interagir com a E. • A escolha do método de imobilização e do tipo de suporte dependerá, essencialmente, de dois fatores: • - das características peculiares da E • - das condições de uso da E imobilizada

  42. Imobilização de Enzimas • Tipos de Suporte • Não existe um método geral de imobilização e nem um suporte universal. Geralmente as condições de imobilização para uma E só poderam ser estabelecidas empiricamente. Vários Suportes e Diferentes Métodos Enzima Imobilizar Escolher o suporte e o método que apresentam > atividade Avaliar a Atividade do Sistema

  43. Imobilização de Enzimas • Tipos de Suporte • Tabela 1. Classificação de suportes inertes.

  44. Imobilização de Enzimas • Tipos de Suporte • Tabela 2. Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em vários suportes e por diferentes métodos.

  45. Imobilização de Enzimas • Tipos de Suporte

  46. Imobilização de Enzimas

  47. Imobilização de Enzimas

  48. Imobilização de Enzimas • Exemplo 1: • AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE LIPASES IMOBILIZADAS EM GEL DE PECTINA (Santos et al.,1997). • Foi realizado um estudo sobre a atividade de diferentes lipases (lipases de Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Mucor javanicus e Lipolase) imobilizadas em gel de pectina, avaliando sua atividade catalítica em meio orgânico.

  49. Imobilização de Enzimas • A pectina  heteropolissacarideo que formar géis em presença de cátions • Preparo do gel de pectina: 9 mL de uma solução tampão fosfato, pH 7,2 0,8 g de pectina cítrica Sol. Aq. de E aquecida até a completa dissolução esfriada a 40°C agitada vigorosa e deixada esfriar a T ambiente.

  50. Imobilização de Enzimas • Foi avaliado a atividade das E imobilizadas neste gel através da reação de esterifcação do ác. láurico com o n-pentanol. • Foram utilizados quantidades equimolares dos substratos (0,01 mol). As reações foram realizadas em uma incubadora sob agitação a 25°C. formar um sist. rígido e estável Gel de pectina Sol. Cl. Cálcio Removidos para um erlenmeyer contendo 25 mL de hexano. Cortados em peq. cubos de 125 mm3