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Borna Disease in a Dog with Lethal Meningoencephalitis

Borna Disease in a Dog with Lethal Meningoencephalitis . Received 4 February 1998/Returned for modification 9 April 1998/Accepted 20 April 1998 . 班級 : 生科四甲 學生 : 陳致融 指導老師 : 張猷忠. Introduction.

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Borna Disease in a Dog with Lethal Meningoencephalitis

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Presentation Transcript

  1. Borna Disease in a Dog with Lethal Meningoencephalitis Received 4 February 1998/Returned for modification 9 April 1998/Accepted 20 April 1998 班級:生科四甲 學生:陳致融 指導老師:張猷忠

  2. Introduction Borna 疾病是熱血動物感染神經學的綜合症狀，導致腦部組織損壞而致命。歐洲最初辨認在綿羊和馬有被辨認出來，它被發現發生在大範圍熱血動物包括鳥、牛、兔子、貓和大主教。從那以後被發現有此病毒的動物地區有以色列、荷蘭、波蘭、俄國、瑞典、英國和美國 。

  3. Borna 疾病發病的特徵 • Borna 疾病通常在動物的伏期通常非常快，最初會使動物打哈欠、昏睡、厭食、四肢無力、絞痛和肌肉收縮，後期會影響到中央神經系統錯亂、腦膜炎和腦脊髓炎。(在人類主要會感染邊緣系統)。Borna病毒漸漸受到關注，但是還有一個未解決的問題「BDV是不是會用動物傳染給人」，要是BDV是否可藉由寵物傳染給人類，此問題就會受到重視。

  4. 病理切片 Fig 1 用Cresyl echt violet染，顯示淋巴的腦膜炎下的血管內皮細胞脹大，軟膜內細胞也有腫脹。(放大110倍)

  5. Fig 1 • 用Cresyl echt violet染下視邱，顯示淋巴球性圍管現象。(放大110倍) • 右下角是用四溴螢光素染下視丘，箭號指出的地方是在核酸內 Joest-Degen內含體裡面的神經元。 (放大510倍)

  6. 從奧地利的福拉爾貝格(Vorarlberg)找一隻兩歲的母哈士奇狗，而這隻狗的臨床病史有厭食及昏睡。作者用電解質、葡萄糖、維他命、胺基酸、非固醇類的消炎劑、和抗生素 等等…經過兩天的治療失敗後。這隻狗逐漸變成了嚴重的神精質，一天後將這隻狗安樂死，因為其臨床症狀被懷疑是得到了狂犬病或是犬溫熱。經神經病理學檢察顯示是一種嚴重的非化膿性腦膜腦炎，其具有淋巴球的腦膜炎的特性。

  7. 探針的標記 • 先將核苷酸序列(T7、SP6)clone到含噬菌體轉錄啟動子的載體(pGEM 3z )中，然後在RNA聚合酶的作用下，以DNA為範本，以含有標記的NTP為原料，對啟動子下游的序列進行轉錄，而啟動子本身並不被轉錄。體外轉錄常用噬菌體(T7、SP6)轉錄啟動子，噬菌體的RNA聚合酶對SP6啟動子序列具有高度的親和性，從而啟動下游的轉錄，在4種dNTP和相應的噬菌體RNA聚合酶存在的條件下，即轉錄成RNA。如反應物中含有標記的dNTP，部分的RNA就被標記。

  8. in situ hybridization(原位雜交) • 利用石蠟把中腦細胞包埋，再用digoxigenin labelle RNA進行ISH。生物體外的方法是由BDV ORF1(open reading frame 1) RNA，而這個RNA有digoxigenin labelle，在拿RNA當probe去中腦的細胞進行混交就可以偵測到RNA

  9. 實驗方法 • 用0.1 N HCl for 10 min室溫 • 在0.1% (wt/vol) pepsin(胃蛋白脢) in 0.1% HCl at 37°C for 20 min • hybridization with partially hydrolyzed(水解) probe at 50°C overnight • 用 13 SSC for15 min 室溫 (2次)和0.13 SSC for20 min 50°C (2次) • 用鹼性的磷酸脢結合antidigoxigenin(抗地高辛)去hybrid特定的標準IHC

  10. 免疫組織化學（Immunochistochemistry,IHC） 利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (螢光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。

  11. 標記抗體與抗原結合方式主要有兩種： • ①直接法：用標記抗體與抗體中的相應抗原直接結合，操作方法簡便，特異性高，但敏感性較差，此法可用於檢定未知抗原； • ②間接法：先用未標記的具有特異性的第一抗體與樣品中的相應抗原結合，然後再以標記的第二抗體與特異性的第一抗體結合；第二抗體是用第一抗體作為抗原注入另一動物體內誘導產生的抗體，然後再結合以標記物。

  12. 免疫化學染色法(IHC)與原位雜交 (ISH)來作比較 • 免疫化學染色法(IHC)與原位雜交 (ISH)來作比較， (IHC)的操作時間比較短，約4-6小時即可完成，而ISH必須隔夜。在設備上(ISH)需使用螢光顯微鏡，而(IHC)只需一般光學顯微鏡即可。在分子生物學上，(ISH)測的是腫瘤細胞的DNA，而(IHC)測的是細胞膜表面的蛋白質。 (ISH)用傳統的分子生物學方法抽取腫瘤組織的DNA或RNA作南方或北方點墨法的時候，很難避免受到鄰近腫瘤組織的間質組織之干擾，會稀釋腫瘤組織所特有的DNA表現，而ISH可以避免這個問題。

  13. RT-PCR • RT-PCR的全名是Reverse Transcriptase PCR （反轉錄酶PCR），其技術原理簡單的來說是將一段待測的RNA序列經反轉錄酶的作用轉錄成cDNA，再利用PCR技術將基因片段以幾何級數倍增的方式增加到數十萬倍，所形成的PCR基因產物經一種叫Ethidium bromide(溴化乙錠)的化學物質作用，利用其會與DNA嵌合，經UV照射時會發出肉眼可見的螢光，即在電泳膠片上會呈現具有特定分子量的PCR基因片段的產(212bp)。

  14. 利用抗生素蛋白和維生素H在神經原顯現出專一性標記利用抗生素蛋白和維生素H在神經原顯現出專一性標記 Astrocytes (星形細胞)

  15. Neurites(神經軸突) 利用抗生素蛋白和維生素H在神經原顯現出專一性標記

  16. 利用抗生素蛋白和維生素H在神經原顯現出專一性標記利用抗生素蛋白和維生素H在神經原顯現出專一性標記 white matter(白質)

  17. 利用抗生素蛋白和維生素H在神經原顯現出專一性標記利用抗生素蛋白和維生素H在神經原顯現出專一性標記 單株抗體(BO18)辨認特別的BDV (p38/40)

  18. 利用ISH以RNA probe表示可以偵測到有感染的RNA, 顯示在神經細胞的細胞質有表現。(放大570倍)

  19. 利用ISH以RNA probe表示沒有偵測到有感染的RNA在牛皰疹病毒沒有顯示

  20. AF054275(狗的BDV，212bp) • CCCAGCCTTGTGTTTCTATGTTTGCTAATCCCAGGACTGCACGCTGCATTTGTTCACGGAGGGGTGCCTCGTGAATCTTACCTGTCGACGCCTGTTACGCGTGGGGAACAGACTGTCGTTAAGACTGCGAAGTTTTACGGGGAAAAGACAACACAGCGTGATCTCACCGAGCTGGAGATCTCTTCTATATTCAGCCATTGTTGCTCATTAC

  21. AF054276(馬的BDV，212bp) • CCCAGCCTTGTGTTTCTATGTTTGCTAATCCCAGGACTGCACGCTGCATTTGTTCACGGAGGGGTGCCGCGTGAATCTTACCTGTCGACGCCTGTTACGCGTGGGGAACAGACTGTCGTTAAGACTGCGAAGTTTTACGGGGAAAAGACAACACAACGTGATCTCACCGAGCTGGAGATCTCTTCTATATTCAGCCATTGTTGCTCATTAC

  22. 結論 • BDV會破壞腦而引起腦膜炎和腦脊髓炎。 • 利用immunohistochemistry(免疫組織化學法)、RT-PCR以及in situ hybridization(原位雜交)可證實狗的腦組織中含有BDV的抗原及BDV特有的RNA。

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