ROL DEL TÉCNICO EN EL LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN

1. ROL DEL TÉCNICO EN EL LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN Instituto de Investigaciones Médicas “Alfredo Lanari” Laboratorio de Neurofisiología

2. LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN INVESTIGACIÓN CLÍNICA INVESTIGACIÓN BÁSICA - Estudio y diagnóstico de las enfermedades neuromusculares con componentes autoinmunes (Miasthenia Gravis, Síndrome de Eaton Lambert, Sindromes Miasténicos Congénitos). - Se han aplicado los conocimientos de la investigación sobre purinas en el diagnóstico de enfermedad bipolar . - Efecto de las purinas (adenosina y ATP) sobre la liberación espontánea de Acetilcolina (ACh) en sinapsis neuromuscular de mamífero .

3. Animales de Laboratorio - Dentro de la Facultad de Medicina funciona el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) , cuyo objetivo es establecer pautas y normas para un adecuado uso de los animales de experimentación. - Los proyectos de investigación en los cuales se utilicen animales, deben contar con la aprobación de este comité. - Considerando a los animales como seres sensibles, se debe evitar o minimizar su sufrimiento.

4. Ratones de Laboratorio Genoma, sistema inmune, metabolismo, anatomía y fisiología muy similares a los de los seres humanos Tamaño apropiado para la crianza y manipulación No requieren de demasiados cuidados Breve período de gestación (19-21 días) y destete rápido Alto número de crías

5. Ratones cepa CF1 • Adultos, ambos sexos, peso corporal: 25-30 g. • Bioterio: criados y mantenidos bajo normas adecuadas. • Alimento y agua a voluntad. • Ciclos de 12 hs de luz artificial y 12 hs de oscuridad. • Temperatura ambiente entre 19-22ºC

6. OBTENCIÓN DE LAS PREPARACIONES - Para realizar la disección del músculo, se anestesia el ratón con Tiopental sódico (50 mg/kg) en forma intraperitoneal. - Los estudios electrofisiológicos se realizan en preparaciones de hemidiafragma izquierdo obtenidas de los ratones. Se elige este músculo porque posee pocas capas de células de espesor, permitiendo por trans-iluminación la visualización de los axones terminales.

7. PREPARACIÓN DE MICROPIPIPETAS - El registro intracelular de la frecuencia de los potenciales de placa miniatura (fMEPPs) se realiza con técnicas convencionales con micropipetas en distintas condiciones experimentales. - Se obtienen a partir de capilares de borosilicato de paredes finas, con filamento interno. - Sus extremos se estiran con un Puller (estirador de pipetas). - Se llenan con ClK (3 M).

8. Puller Estiramiento de capilares Micropipeta en holder Llenado de micropipetas

9. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES - La solución base que se utiliza es Ringer Krebs (Ringer Normal). - Su composición en sales es similar a la de la sangre (ClNa, ClK, Cl2Mg, Cl2Ca, Glucosa, Hepes) - Se lleva a pH 7.2-7.4 - Se modifica agregando diferentes reactivos, según el protocolo experimental (agonistas, antagonistas, bloqueantes, inhibidores) + - - Para la ejecución de los experimentos, las soluciones se colocan en la cámara de registro en cantidad suficiente como para que la preparación se encuentre inmersa en el líquido.

10. Investigación Clínica • En el suero de los pacientes con Enfermedades Neuromusculares se encuentran anticuerpos (IgG) dirigidos contra componentes esenciales en la secreción del neurotransmisor (ACh). • Para investigarlos, se utiliza el modelo de transferencia pasiva de esos sueros a ratones, y el posterior estudio de la transmisión neuromuscular en los diafragmas de los animales receptores. • - El diagnóstico de los pacientes fue realizado clínicamente por neurólogos idóneos.

11. Transferencia pasiva de suero al ratón 1- Extracción de 20 ml de sangre del paciente 2- Se separan los sueros y se conservan en el freezer a -20ºC hasta su utilización 3- Inyección ip 1ml/día durante 2 días 4- Disección del hemidiafragma izquierdo al 3° día 5- Registro de amplitud de MEPP

12. MUCHAS GRACIAS