Bunková terapia a Mezenchýmové stromálne bunky

1. Bunková terapiaaMezenchýmové stromálne bunky JánRosocha Univerzita Pavla Jozefa Šafárika – Lekárska fakulta a Fakultná nemocnica Louisa Pasteura – Košice

2. Ak si myslíte, že výskum je drahý, tak vyskúšajte chorobu... Mary Lasker, filantrop

3. Možnosti klasickej farmakoterapie a možnosti bunkovej terapie • Hlavným dôvodom prečo sa začala rozvíjať regeneračná medicína je limit – obmedzenie dnešných možností klasickej farmakoterapie sociálne závažných ochorení, medzi ktoré patria aj neurodegeneračné ochorenia, ochorenia srdcovo cievneho systému a poškodenia skeletu.

4. Kmeňová bunka • Prečo práve kmeňová bunka ako prostriedok terapie? • Práve pre jej unikátne vlastnosti • Plasticita • Produkcia ECM • Produkcia extrémnej škály biol. aktívnych molekúl

5. Regeneračná medicína Ľudské telo disponuje mnohými autonómnymi regeneračnými mechanizmami, ktoré sú založené na bunkových interakciách a na mikroprostredí poškodeného tkaniva. Pre správanie sa naivnej bunky je mikroprostredie hlavným motívom jej diferenciácie.

6. Bunková terapia a jej povaha • Bunky sú netradičné medicínske produkty ! • Bunkové implantáty majú charaktertransplantátov, biologických látok a implantátov. • Bunky môžu byť aplikované vkombináciis umelými a prírodnými materiálmi. • Cena bunkových implantátov závisí od:1.Know-how investovanéhodo vývoja, 2.Terapeutickéhopotenciálu, 3. Terapeutickéhoefektu.

7. Mezenchýmové kmeňové bunky

8. Mezenchýmové stromálne bunky • História sa začala objavmi Friedensteinav 60. a 70. rokoch, kedy v kostnej dreni bola okrem KKB nájdená aj netradičná - adherentná - multipotentná bunka. • Dnes vieme, že MKB môžu opravovať poškodené tkanivá priamo alebo prostredníctvom dvoch základných mechanizmov : • Stimuláciou proliferácie a diferenciácie kmeňových buniek, ktoré sú v tkanive. • Prenosom mitochondriálnej DNA do buniek s nefunkčnými mitochondriami.

9. Mezenchýmové stromálne bunky • Ľudské MKB infundované do hipocampuimunodeficientnýchmyšístimulujúneurogenézu prostredníctvom endogénnych neurálnych kmeňových buniek. • Ko - kultiváciou MSCs s bunkami s nefunkčnými mitochondriami dochádza ku tvorbe buniek s funkčnými mitochondriami, čo je výsledok prenosu mitochondrií alebo mitochondriálnej DNA z MSCs.

10. Mezenchýmové stromálne bunky • Intravenózne podané hMSCs znižujú krvnú glukózu, zvyšujú hladinu inzulínu a znižujú morfologické zmeny v renálnychglomeruloch u experimentálneho indukovaného diabetu.

11. MSCs a sclerosis multiplex • MKB izolované z KD sú v súčasnosti intenzívne študované vzhľadom na ich možné použitie pre liečbu autoimunitných ochorení. • Štúdie in vitro poukázali na fakt, že MSC majú výrazný antiproliferačný účinok na T a B lymfocyty, dendritické bunky, NK bunky ako aj na rozličné B bunkové nádorové línie.

12. MSC a SM • Antiproliferačný účinok je dosiahnuteľný tak priamym kontaktom „bunka – bunka“ ako aj prostredníctvom solubilných faktorov – TGF beta, IL-10, indoleamin 2,3 dioxygenáza, IL-1RA a HLA – G, a pravdepodobne aj ďalších biomolekúl. • Sú pravdepodobne aj ďalšie antiproliferačné a imunoregulačné mechanizmy MSC , ktoré najpravdepodobnejšie indukujú prerušenie bunkového cyklu vo fáze G0/G1.

13. MKB a SM • Primárne očakávania, že MSC sú imunoprivilegované sa postupne – po animálnych pokusoch (ischemické obličky, chemicky indukovaná pľúcna fibróza a poškodenie pečene) dostávajú do realistickej podoby, ale napriek tomu, bolo vykonaných už niekoľko veľmi sľubných experimentálnych terapií.

14. MKB a experimentálna liečba • Systémová aplikácia MKB bola uskutočnená u akútnej GVHD, roztrúsenej sklerózy a u Crohn-ovej choroby. • Prospektívna fáza I sa začína u roztrúsenej sklerózy a u Crohn-ovej choroby. Vykonanie klinickej štúdie sa taktiež zvažuje u inflamatórnej reumatickej choroby.

15. Čo je dôležité ? • Bezpečnosť: • Doterajšie výsledky ukazujú, že MSC sa inkorporujú do strómy tvoriacich sa nádorov. • MSCs samotné však po systémovom podaní nádory neindukujú. • MSC sú považované za bezpečné. - Závery EBMT 2008

16. Aké sú zdroje MSC ? • Kostná dreň • Tukové tkanivo • Pupočníková krv • Pupočníkový reťazec • Kostrové svalstvo • ....

17. MSCs a ich potenciál pre autoimunitné ochorenia • Sclerosis multiplex • Systémový lupus erytematosus • Juvenilná idiopatická reumatoidná artritída • Refraktérna autoimunitná cytopénia • Crohnova choroba • . • .

18. Ďalšie adultné kmeňové bunky

19. Multipotentnéadultnéprogenitorové bunky - MAPCs • Bunky odlišné od hMSC, izolované Dr. Verfailie z KD pomenované ako MAPCs,majú omnoho väčší differenciačnýpotenciálale pritom stále menší ako majú embryonálne kmeňové bunky. • Transkriptómováanalýza ukázala,žeMAPCs sa výrazne odlišujú od ostatných adultnýchmultipotentných kmeňových buniek a exprimujú aj viaceré – nie však všetky gény asociované s endodermom a mezodermom.

20. Selfrenewingstromalprogenitors Veľmi kvalitná vedecká skupina zoskupená okolo Dr.Bianco(Rome, Italy) identifikovala tzv. „ self renewing stromal progenitors“ s dominantným antigénomCD146ako markerom vhodným pre identifikáciu ich : • Klonogénnehopotenciálu (tvorba CFU F in vitro) • Definíciu partnerských buniek po ich implantácii in vivo(adventicálneretikulárne bunky) • Sledovanie ich osudu - distribúciepotransplantácii

21. Selfrenewingstromalprogenitors • „Biancovestromálne bunky“ z kostnej drene - (CD146/MCAM) si aj po mnohých pasážach zachovávajúexpresiu všetkých génovpotrebných pre udržiavanie „niche“prekrvotvorné bunky(vrátane antigénovCXCL12, Jagged-1 a angiopoietin-1). • CD146+ stromálne bunky však môžu taktiež vytváraťheterotopickémetastatické mikroprostredie, ktoré môže byť následne kolonizované cirkulujúcimi nádorovými bunkami.

22. Klasifikácia kmeňových buniek • Totipotentná – bunka zygoty do prvých troch bunkových delení. Každá bunka je schopná dať základ pre tvorbu nového jedinca. • Pluripotentná – bunka blastocysty po prvých 5 dňoch kultivácie embrya, keď vonkajšia vrstva dáva základ pre placentu a vnútorná masa – cca 50 buniek – dáva základ pre tvorbu všetkých orgánov tela. • Multipotentná– adultnábunka, dáva základ pre tvorbu jednotlivých tkanív.

23. Zdroj: NIH Totipotentná Pluripotentná M u l t i p o t e n t n á

24. Čo je dôležité pre pacienta? • Bezpečnosť !!! • a • Účinnosť

25. Ako preukázali viaceré štúdie:Kmeňové bunky môžu byť bezpečne použité na terapeutické účely pre docielenie regenerácie poškodeného tkaniva. (Gussoni et al, 1999; Kalkaet al, 2000; Lagasse et al, 2000, 2001; Bianco & Robey, 2001;Forbes et al, 2002;Badorff et al, 2003; Grove et al, 2004; Guoet al, 2004; Petite et al, 2000; Ramiya et al, 2000; Stock &Vacanti, 2001; Rafii & Lyden, 2003; Losordo & Dimmeler,2004)

26. Minimálnekritériá pre multipotentné mezenchýmové stromálnebunky. The International Society for Cellular Therapy M. Dominici, K. Le Blanc, I. Mueller, I. Slaper-Cortenbach, F.C. Marini, D.S. Krause, R.J. Deans, A. Keating, D.J. Prockop and E.M. Horwitz

27. Kritériá pre hMKBpodľa ISCT • Adherencia:voči plastickému povrchu v štandardných statických kultivačných podmienkach • Fenotyp: Min 95% pozitivita naCD105, CD73, CD90 Max 2% pozitivita na CD45, CD34, CD14 alebo CD11b, CD79a alebo CD19, HLA-DR 3. In vitro diferenciácia: osteoblasty, adipocyty, chondroblasty

28. Nový marker pre hMSCs Nízko afinitný “nerve growth factor” – CD271bright(nie CD271dim)je najšpecifickejší marker hMSC. Optimálna kombinácia povrchových antigénov ľudských MSC je CD 271 bright CD 45 -

29. MSC a placentárna krv • Všetky hMSCexprimujú – CD10, CD13 aCD105. Taktiež však koexprimujúPDGF-R (CD140b), TRA-1-2-49/6E, HER-2/erbB2 (receptorepidermálneho rastového faktora - CD340) a frizzled-9 (FZD-9; CD349). • MSCsizolované z placenty neexprimujú antigén CD271, sú však pozitívne na antigénFZD-9. • Kombinácia FZD-9, CD10/CD26 jeodporúčaná • preizoláciu MKBz placentárnej krvi.

30. Rozdiel medzi kmeňovými krvotvornými s mezenchýmovými kmeňovými bunkami

31. Expresia génovu ľudskýchmezenchýmovýchstromálnychbuniek • MKB môžu byť získané ako frakcia, ktorá je depletovaná okrvotvorné(CD45+)a mikrovaskulárne(CD31+ HLA DR+)bunky. • Vo všeobecnosti je expresia génovuin vitronekultivovanýchmezenchýmových a krvotvornýchje podobná. • Dôležitý je rozdiel medzi génmi patriacimi do imunitného systému a génmi pre cytokíny.

32. Expresia génovu ľudskýchmezenchýmovýchstromálnychbuniek • Expresia génov u HSCsreflektuje fakt, že tieto bunky sa vyvinú do antigén prezentujúcich buniek ako aj do ostatných buniek imunitného systému. • Expresia génov uMSCsvšak dokazuje, že tieto bunky sú prekurzormipre bunky, ktoré tvoria niche (mikroprostredie) pre HSC.

33. “Unrestricted somatic stem cells” (USSC) z placentárnej krvi • Adherentné, fibroblastoidné bunkys fenotypom: CD45-, CD13+, CD29+, CD73+ and CD105+. • Tieto bunky majú mezenchýmový a neuroektodermálnydiferenciačný potenciál – osteoblasty, chondrocyty, adipocytya neuróny. • Nie - krvotvornékmeňové bunky v pupočníkovej • krvi sú teda viac ako jednoduché MSCs.

34. Unrestricted somatic stem cells (USSC) z placentárnej krvi (2) • USSC z pupočníkovej krvi sa diferencujú aj do hepatocytov – endodermálneho tkaniva (cca 50% buniek) • USSCje teda bunka s potenciálom tvoriť tkaniváendodermálneho, ektodermálneho a mezodermálneho pôvodu. USSC ako aj BM MSCs podporujú krvotvorbu a zlepšujú prihojenie sa štepu kmeňových krvotvorných buniek.

35. “Very small embryonic-like” kmeňové bunky - VSEL z kostnej drene • Homogénna populáciaz KD(0,01%), ktoráexprimuje markery pluripotentnýchkmeňových buniek: SSEA-1, Oct-4, Nanog and Rex-1 a vysoko exprimuje antigén akoRif-1 telomerázový proteín. • VSELs sa môžu stať veľmi dôležitým zdrojom • pluripotentných buniek pre regeneráciu.

36. Multipotentné bunky z tukového tkaniva • Predstavujú ohromný potenciál pre regeneračnú medicínu. • Majú obrovskú samo obnovovaciu kapacitu, normálny diploidnýkaryotyp a sú schopné diferencovať sa do mnohých mezenchýmových bunkových typov aj po extenzívnej in vitro expanzii.

37. Multipotentné bunky z tukového tkaniva – fenotyp • VEGF-R2, glycophorin A, CD34, CD15, CD117, CD133, CD49b, CD44, CD90, CD105 and CD13. • Sú veľmi podobné MSCs izolovaným z KD. • Aj to mnohých pasážach bunky exprimujú • iba malé množstvá HLA triedy I a vôbec • neexprimujú HLA triedy II.

38. MSCs a protinádorová liečba • MSCs sa integrujúdo nádorov ako stromálne elementy(Canc Res, 2004) • Ich rekombinácia s IFNpredĺžuje prežívanie experimentálnych zvierat s melanómom, gliómom, metastatickým karcinómom prsníka a vaječníkov. Terapeutické použitie MKB je v štádiu klinickej štúdie.

39. MSCs pre regeneráciu obličky – parakrinný efekt • Intrakarotické podanie MSCs pri akútnom zlyhaní obličiek okamžite alebo do 24 hodín po obličkovej ischémii vyústi do signifikantného zlepšenia obličkových funkcií (zníži poškodenie obličky a zníži infiltráciu leukocytov v obličke) • Pro-inflamatórnecytokíny(IL1, TNF, IFN a iNOS)sú u liečenej • obličkypo podaní MKB signifikantne znížené pričom anti – • inflamatórne(IL 10, bFGF,TGF and Bcl 2)sú vysoko zvýšené.

40. Imunomodulácia • MSCs inhibujúnaivné a pamäťové špecifické T bunkyindukcioutzv. „split immunoanergy“pričomT bunkysa stávajú neschopné proliferácie ale zachovávajú si čiastočne svoje efektorové funkcie. • MSCs taktiež inhibujúdiferenciáciu a funkciedendritických buniek a B buniek.

41. Záver • Adultná kmeňová bunka so svojim diferenciačným potenciálom do všetkých zárodočných vrstiev má svoje opodstatnenie pre liečbu veľkej škály ochorení, vrátane roztrúsenej sklerózy. • MSC predstavuje budúcnosť v génovej terapii. • MSC je terapeuticky bezpečná.

42. T bunky a MSCs • Protilátka proti receptoru IFNinhibuje immunosupresívne vlastnosti MSCs. • Efekt je čiastočne závislý na medzibunkovej interakcii. • INF indukuje IDO aktivitu MSCs. • MSC indukujú zástavu bunkového cyklu v G0/G1 fáze T buniek prostredníctvom inhibíciecyklínu D2 a p27kip.

43. Ľudské MSCsmodulujú funkcie B buniek • Úzka interakcia progenitorových B buniek s MSCs – výrazne ovplyvňujú B bunkovúlymfopoézu a ich proliferáciu a produkciu protilátok. • Galectin 1je stromálny bunkový ligand na povrchu MSC pre pre-B bunkový receptor. • Je súčasťou tvorby synáps medzi pre-B bunkou a stromálnou bunkou.

44. Ľudské MSCsmodulujú funkcie B buniek(2) • MSCs inhibujú proliferáciu B-lymfocytov čiastočne cez priamy kontakt a čiastočne cez produkciu solubilných faktorov.