TB PCR

1. TB PCR 2004. 3. 3. 박 수 현

2. 핵산(Nucleic acid) • 발견 - Friedrich Miescher • (1869 스위스 생물학자) • 구성 • 1) 오탄당 (pentose) • D-ribose (RNA) 2-deoxy-D-ribose (DNA) • 2) 염기 • - 아데닌 (A ; Adenine ) • - 구아닌 (G : Guanine ) • - 시토신 (C : Cytosine ) • - 티민 (T : Thymine ) • - 우라실 (U : Uracil ) • 3) 인산기 (H3PO4)

3. DNA • 핵산의 일종으로 유전자의 본체 • 분자구조 - 이중 나선 구조

4. PCR (Polymerase Chain Reaction) Polymerase chain reaction(PCR)은 1983년 Mullis와 Faloona가 처음으로 개발한 시험관에서의 DNA 증폭 방법으로, PCR은 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제 특징을 이용한 것이다. 유전자를 분석하고 연구하는데 있어서 가장 큰 문제점은 복잡한 전체 genome중에 연구하고자 하는 유전자가 희귀하다는 것인데, PCR은 Genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시키므로 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를 105～108배까지 수시간내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 유전자 클로닝을 포함한 분자유전학, 의학생물학, 집단유전학등 생명과학의 전 분야에 혁신을 일으켰다. 특히 유전병 관련 유전자 탐색 및 발현, 증폭 DNA로부터 직접 염기서열의 결정 그리고 DNA footprinting 및 유전자 지도 작성등에 손쉽게 이용될수 있다.

5. 중합효소 연쇄반응이 이용되는 실험 1) Probe로 사용할 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭 2) 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning 3) DNA sequencing , 유전자의 footprinting 4) 돌연변이 검사 5) 병인성 바이러스 및 박테리아 검출 6) 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조 (site directed mutagenesis) • 중합효소 연쇄반응의 의학적 응용 1) HLA형의 결정 2) 법의학: 특정인의 유전자 검출 3) 암유전자의 검출: ras, myc, fos 등 4) 유전성 질병의 진단: Progressive muscular dystrophy(Duchenne type)등 5) 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등

6. TB PCR .개요 결핵은 Mycobacterium tuberculosis 에 의해 일어나는 전염성 질환으로 폐를 가장 많이 침범하지만 콩팥, 림프절, 뇌, 관절, 피부등 모든 장기에 감염되며 임상증상은 피로, 쇠약, 체중감소,발열 등이 있다. 만성 감염 질환인 결핵의 진단은 환자의 임상증상, X-선 촬영, 객담검사, 객담의 결핵균 배양 등으로 실시한다. .결핵균 진단법 ■염색법 - 장점 간단하고 신속하게 결과를 얻을 수 있다 단점 결핵균과 비결핵성 항산균의 구별이 어렵다. ■결핵균 배양법 –확진 방법이지만 배양기간이 4주이상 소요된다. ■ PCR진단법 - 빠른 시간 내에 결핵균과 비결핵균의 동정이 가능하며 민감도가 높아 객담은 물론 균 수가 적은 body fluid나 urine등의 검체에서도 결핵균 진단이 가능하다

7. 검사 방법1. DNA Extraction 1) Sputum • 1N NaOH를 첨가하여 끈끈한 Sputum 을 풀어주고 500㎕를 취하여1.5㎖ tube에 옮겨 담는다. • Centrifuge 13000rpm / 10min. • 상층액을 버리고 남은 침전물에 500㎕ washing solution 첨가 후 mix 한다. • Centrifuge 13000rpm / 10min. • ③, ④ 과정을 2회 반복한다. • 상층액을 버리고 침전물에 50㎕ hydrolysis buffer 를 넣고 중탕으로 20분 이상 끓인다. • Centrifuge 13000rpm / 8min at 4℃ • 원심분리한 sample의 상층액을 취하여 PCR에 사용한다.

8. 2. BAL, Body fluid, CSF, Urine, Pus, tissue등 • 2,000rpm 10분간 원심분리한다. • 상층액을 버리고 남은 침전물에 TE buffer 570㎕, 10% SDS 30㎕, PK 3㎕ 넣고 53~56℃에서 3시간 Incubation한다. • 위 sample에서 400㎕ 를 취하여 새 tube에 옮긴 뒤 Phenol을 동량 넣고 mix한다 • Centrifuge 13,000rpm / 8min. • 상층액을 300㎕ 취하여 새 tube에 옮긴 뒤 Chloroform을 동량 넣고 mix한다. • Centrifuge 13,000rpm / 8min. • 상층액을 200㎕ 취하여 새 tube에 옮긴 뒤 1/10 vol.의 3M Sod. Acetated (PH5.2)와 2vol.100% EtOH을 넣고 mix한다 • -70℃,15분 or -20℃, 1시간 ~ over night • Centrifuge 13,000rpm / 8min. • 상층액을 버리고 70% EtOH 800 ㎕ 넣고 washing한다. ⑪ Centrifuge 13,000rpm / 8min. ⑫ 상층액을 버리고 56℃ Heating block 에서 건조 시킨다. ⑬ D.W 100㎕를 넣고 63 ℃ water bath 에서 10분간 incubation 시킨다.

9. 2. PCR 반응액 조제 1. Template DNA 선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편 2. Primer Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 20bp 내외의 염기서열에 대응하는 Oligonucleotid를 합성하여 이용한다. 3 dNTP (deoxynucleotide triphosphate) 4. 10x PCR 완충용액 1) Magnesium / KCl – Taq DNA polymerase 의 activity primer와 template DNA의 결합력 2) Gelatin 또는 bovine serum albumin(BSA) 5. Taq DNA polymerase

10. 3. PCR반응

11. Agarose Gel Electrophoresis • 1.5~2% agarose gel 에 PCR product를 전기 영동하여 결과를 판정한다. 1 - size marker 3,4 - Positive 2,5,6,8,9,10,11 - Negative 7 - Positive control 12 - Negative control • 결과 보고 control size와 동일한 크기의 band가 있는 경우 - Positive control size 동일한 크기의 band가 없는 경우 - Negative 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

12. TB PCR 검사 • 검사일 –월, 수, 금 (주 3 회) • 검사 소요 시간 - 2일 (전일 검체 접수 기준) • 검체 종류 – Sputum, BAL, Body Fluid, CSF, pus, stool, urine, tissue, lymph node….등