PCR

1. PCR Prof. Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale, Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)

3. 1978 Prima diagnosi molecolare sul DNA *Primo ormone umano ricombinante (insulina) *Premio Nobel agli scopritori degli enzimi di restrizione *Identificato l’AIDS *Prodotto il depakene (epilessia) *Prima bambina in provetta (Luise) *Appare sul mercato l’Apple Computer ed i floppy disk

4. Com’era l’analisi genetica prima della PCR? • Il Southern blotting (1975) permetteva un’analisi approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni & delezioni) • Il sequenziamento del DNA (1978) richiedeva che I geni venissero prima clonati in appositi vettori (plasmidi o fago l) • La costruzione di genoteche e lo screening potevano richiedere molti mesi e le genoteche dovevano essere preparate per ciascun individuo analizzato

5. Restriction Enzymes cut in different ways:

6. L’invenzione della PCR • Ideata da Kary Mullis nel 1983 • La prima pubblicazione è apparsa nel 1985 • Premio Nobel per la chimica nel 1995

7. 1985 Descritta la reazione di PCR Parte il progetto genoma umano Costo giornale £ 650 Tazzina Caffè £.400

8. DNA PCR Molte molecole (singola molecola) amplificazione Polymerase Chain Reaction - PCR La PCR rappresenta la seconda rivoluzione nelle tecniche di manipolazione del DNA E’ essenzialmente una tecnica di amplificazione del DNA

9. Polymerase Chain Reaction • Metodo per l’amplificazione esponenziale di sequenze di DNA • Ingredienti di base • Stampo di DNA o RNA • 2 primers complementari a differenti regioni dello stampo • DNA polimerasitermostabile • 4 nucleotidi • il buffer appropriato

10. Schema della PCR Estrazione del DNA o RNA dal campione DNA Reverse transcription RNA Amplificazione DNA Rivelazione

11. COMPONENTE VOLUME Concentrazione finale 10 X PCR Buffer 5l 1X 10 X dNTPs (2mM) 5l 200M Forward primer (5 pmols/l) 5l 0.5M Reverse primer (5 pmols/l) 5l 0.5M (25pmols/50l) DNA genomico stampo 2l 1g polimerasi termostabile (5U/l) 0.2l 1 unità H2O (a 50l di volume finale) 27.8l TIPICA MISCELA DI REAZIONE 25 o 50l in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml)

12. I cicli della PCR • 30–35 cicli ciascuno comprendente: • denaturazione (95°C), 10-40 sec • annealing (50–65°C), 30-120 sec • polimerizzazione(68-72°C),il tempo dipende dalla lunghezza del frammento

13. Thermal cycler, AppliedBiosystems

14. Thermal Cyclers, MJ Research

15. Thermal Cyclers, MJ Research

16. “Tutti I blocchi sono uguali ma alcuni sono più uguali di altri!” Taken from -http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/PCR.html

17. 5’ -T A C G • Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * 3’ T A C G T A Uno specifico DNA a singola elica (primer o innesco) ibrida con l’elica che deve essere copiata

18. Come funziona la PCR • Come fa la polimerasi a sapere quando fermarsi una volta che ha raggiunto l’altro primer? • PCR animation alla “Dolan DNA Learning Center, CSHL, Cold Spring Harbor”

19. Quanto è potente la PCR? • La PCR può amplificare fino ad ottenere una quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in meno di 2 ore • Lo stampo di DNA non necessita di particolari purificazione se il frammento da amplificare è di dimensioni ridotte (fino a 1000bp) • Il prodotto della PCR può essere digerito con enzimi di restrizione, sequenziato o clonato • La PCR può amplificare una singola molecola di DNA (es. uno spermatozoo)

20. Elettroforesi su gel : Separa le molecule per dimensione separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA separation verticale --> Acrilamide = DNA, proteine ed RNA le molecole più piccole migrano nel gel più velocemente

21. Elettroforesi su gel: visualizzazione diretta delle molecole separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA

22. Il DNA colorato con bromuro di etidio emette una fluorescenza di colore rosso-arancio se sottoposto a luce UV

24. UCSC Genome Browser on Human July 2003 Freeze Screenshot from University of California at Santa Cruz http://genome.ucsc.edu PTEN gene

25. Mutation screening from genomic DNA

26. Mutation screening from RNAby RT-PCR

27. Quante copie? • Nessun prodotto fino al 3° ciclo • L’accumulazione non è un raddoppiamento completo dopo ciascun ciclo • Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere max 1,073,741,764 copie di lunghezza definita (~1109)

28. How Big A Target? • Amplification products are typically in the size range 100-1500 bp. • Longer targets are amplifiable — >25 kb. • Requires modified reaction buffer, cocktails of polymerases, and longer extension times. • Limited by the integrity of the starting target DNA — > 50 kb.

29. Designing PCR Primers • Primers should be ~20 bases long. • The G/C content should be 45–55%. • The annealing temperatures should be within 1°C of one another. • The 3´-most base should be a G or C. • The primers must not base pair with each other or with themselves or form hairpins. • Primers must avoid repetitive DNA regions.

30. Primers That Form Dimers • A primer may form a dimer with itself or with the other primer. 5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´ |||||||||| 3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´ • Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase.

31. Primers That Form Hairpins • A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin: 5´-GTTGACTTGATA ||||| T 3´-GAACTCT • The 3´ end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA.

32. Optimising the PCR Reaction • Annealing temperature of the primers. • The concentration of Mg2+ in the reaction. • The extension time. • (The denaturing and annealing times.) • (The extension temperature.) • (The amount of template and polymerase— “more is less”.)

33. Optimising the Annealing Temperature • Primers have a calculated annealing temperature(e.g. 54°C). • Temperature must be confirmed practically. • Temperature steps of 2°C above and below. • Use gradient cycler.

34. Optimising the Mg2+ Concentration • The fidelity of the PCR depends on [Mg2+]. • Vary [Mg2+] in steps of 0.5 mM. • Sometimes a compromise between yield and specificity.

35. ADDITIVi? DMSOFormamideGlicerolo QIAGEN – Q Stratagene - Perfect Match

36. Nested PCR

37. False positive PCR • Contamination • at the time of specimen collection • during transport • in the laboratory from other patient samples or positive control material • negative controls used to detect contamination • Primers are not specific enough • do additional confirmatory tests • PCR for other targets, additional tests to confirm the identity of the product

39. General applications of PCR (1)

40. General applications of PCR (2)

41. Restriction site polymorphism analysis by PCR

42. Genotyping

43. Allele-specificPCR

45. Fidelity of the Reaction • Taq DNA polymerase lacks the 3´5´ proof-reading activity commonly present in other polymerases. • Taq mis-incorporates 1 base in 104. • A 400 bp target will contain an error in 33% of molecules after 20 cycles. • Error distribution will be random.

46. Do Errors Matter? • Yes, if you want to clone the amplified DNA — an individual molecule may harbour several mutations. • No, if you want to sequence the amplified DNA or cut it with restriction enzymes. • Use a proof-reading thermo-stable enzyme rather than Taq.

47. Cloning PCR Products • Products should be ligatable into blunt-ended restriction enzyme site. • Lower than expected efficiency. • Products are not truly blunt-ended. • Taq polymerase adds a single non-templated base (usually A) to the 3´ end: NNNNNNN…NNNNNNNAANNNNNNN…NNNNNNN

48. Cloning of PCR products

49. Can I PCR Amplify RNA? • Not directly — the DNA polymerase requires a DNA template and will not copy RNA. • mRNA can first be copied into cDNA using reverse transcriptase. • cDNA is a template for PCR — it need not be double-stranded.

50. Multiplex PCR • PCR reactions can be devised in which several targets are amplified simultaneously — often used in diagnostic applications.