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PCR ( P olymerase C hain R eaction)

PCR ( P olymerase C hain R eaction). 聚合酶链反应. 目 的：. 熟悉 PCR 技术的基本原理和操作. 历 史. 1983.4 Kary Mullis 在开车前去北加利福尼亚红树县 Redwood country 的一条被 月光笼罩 的山路上构思了 PCR 随后卖给了 Roche 公司 价格： 10.000$ 1993 Nobel prize. PCR 的基本原理. 变性、复性、半保留复制. PCR 三步曲. 变性 90 ～ 97℃. 退火 45 ～ 55℃.

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PCR ( P olymerase C hain R eaction)

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Presentation Transcript

  1. PCR (Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链反应

  2. 目 的： 熟悉PCR技术的基本原理和操作

  3. 历 史 1983.4 Kary Mullis在开车前去北加利福尼亚红树县Redwood country的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格：10.000$ 1993 Nobel prize

  4. PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 • PCR三步曲 • 变性 90～97℃ • 退火 45～55℃ • 延伸 72℃左右 PCR过程 • 一生二，二生四，四生万物

  5. PCR引物设计 一对引物，分别与5 ′和3′端互补 长度：15～30个核苷酸 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性

  6. PCR反应体系的五要素： • 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ • Taq DNA聚合酶 • 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus • 良好的耐热性 • Mg2+依赖性 • 无校读功能

  7. PCR反应体系的准备 +Taq polymerase (Thermus aquaticus ) + nucleotides + primers + salts (ions) + DNA fragment

  8. Step 1 : Denaturation 变性 94°C TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

  9. Step 2 : Annealing 退火 T° primer-dependent TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT GCTGCTACGTAG CGTAGTAGCA ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

  10. Taq Polymerase Taq Polymerase Step3 : Extension 延伸 72°C TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA GCTGCTACGTAG TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC CGTAGTAGCA ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

  11. Next step : Cooling You get two copies of your DNA TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

  12. PCR Process Process 变性 退火 延伸 1 cycle 2 cycle 3 cycle

  13. 加样器的使用

  14. 模板的制备 DNA • 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 • 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 RNA • 新鲜组织或细胞 • 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理

  15. (一) 组织处理： 取新鲜大鼠肝用预冷的生理盐水洗去表面血液，每克肝脏加2ml的裂解液，匀浆器中匀浆

  16. PCR反应 （一） 引物： 5’ –TTTTCGTAGTAACGGAAGCC-3 ’ 5’ –TAAGGATTCTCAGATGCAAATG-3 ’ 引物的设计可以参照： 两分钟StepByStep学会引物设计软件 Primer premier5.0/oligo软件 www.dxy.cn 核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版/ PCR技术讨论版

  17. （二） 无菌eppendorf管中加 • 双/三蒸水 9 l • 10×缓冲液 2 l dNTP混合物 3 L引物 　　　 2 l 模板DNA 2 l 25mmol/L Mg2+ 2.5 l • 液体石蜡　 10 l 混匀离心5sec， 94℃水浴，2min

  18. + Taq DNA聚合酶 　 0.55 l 程序设置： 94℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 30s 35个循环 （一般在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒） 反应结束后加中止液10 l （三）扩增结果：220-242 bp 对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。双温PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃

  19. PCR中的注意事项 • PCR反应中可能出现的问题： • 假阴性，不出现扩增条带 • 假阳性 • 出现非特异扩增带

  20. （一）防止污染 • 试剂小量分装 • 吸头及EP管一次性使用 • 器皿及工作区域要分开，无菌操作 • （二）设立对照： • 阳性对照： 阳性模板 • 阴性对照： 阴性模板 • 试剂对照： 除模板外的所有组分

  21. PCR的反应特点 • 特异性强 • 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将pg=10- 12级的起始待测模板扩增到微克(g= 10 -6)水平 • 简便、快速：PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应 • 对标本的纯度要求低： • DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测

  22. 电泳操作步骤 1、凝胶准备 用0.5×TBE配制1％琼脂糖凝胶。 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 0.5μl，并轻轻混匀 2、胶床准备 ①取出胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成约5～8mm的挡墙 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙 ③将胶床放在调整好的水平台上

  23. 3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶 床内，凝胶厚度3～5mm 4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床 两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中， 并使样品孔位于电场负极 5、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，越 过凝胶表面即可 6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。 原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如发现 有气泡，应设法去除 7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积 1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀

  24. 8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝 胶的样品孔中。加样量一般10μl 9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压50v；时间0.5小时左右 10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带 ②摄影记录

  25. 注意事项： 1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定， 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计 2、用胶布封闭胶床两端时，要确保严密，以免 灌胶时有胶液漏出 3、用微波炉熔化琼脂糖时，以免突然产生气泡，使琼脂糖溢出来 4、凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除 6、电泳前，确认样品孔位于电场负极 7、因EB存在，全部操作过程要带防护手套

  26. 琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围 胶浓度（％） 线性DNA分子大小（kb） 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～4 2.0 0.1～3

  27. maker

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