Cinetica della risposta delle cellule T e B ad un’infezione acuta

1. Cinetica della risposta delle cellule T e B ad un’infezione acuta

2. Cinetica della risposta delle cellule T e B ad un’infezione acuta

3. L’Immunità Adattativa non sempre viene attivata

4. Le CELLULE NATURAL KILLER: cellule con licenza di uccidere

5. Le cellule NK si trovano: • Nel sangue (15-20% linfociti) • Nella milza • Nei linfonodi (uomo: circa 5% dei linfociti) • Nei tessuti periferici (fegato, cavità peritoneale, epiteli?)

6. Una volta attivate le cellule NK: • Hanno attività citolitica diretta (perforina) • Producono citochine (IFNg, TNFa, TGFb) • Producono chemochine (MIP-1b)

7. Regolazione dell’attività delle cellule NK: le “split responses” Le cellule NK rispondono diversamente a diversi stimoli: l’induzione di citochine e la risposta citotossica sono controllate da vie differenti Linee tumorali Risposta anti-virale

8. NK Cell’S

9. Il “bacio della morte”: I granuli litci sono trasportati alla immunosinapsi grazie ad una riorganizzazione dei microtubuli

10. L’ attività citolitica diretta delle cellule NK è mediata da perforina • La perforina forma pori di 15-16 nm alterando la membrana plasmatica delle cellule target • Alla perforina si aggiunge l’azione dei: • Granzyme A (tagli in ssDNA) • Granzyme B (via delle caspasi)

11. Le cellule NK sono protette grazie: Al rilascio dei diversi mediatori citotossici ESCLUSIVAMENTE a livello della sinapsi Alla presenza di una forma legata alla membrana della Catepsina B (che è in grado di tagliare la perforina)

12. Come si attivano le cellule NK?

13. Le cellule NK sono linfociti dell’immunità innata • che esprimono: • Recettori inibitori • Recettori attivatori

14. I Recettori INIBITORI: Nel 1986 Klas Karre propone la teoria del MISSING SELF Secondo questa teoria le cellule NK hanno dei recettori inibitori che riconoscono molecole MHC di classe I e che inibiscono l’attività citolitica delle cellule NK: Esperimenti di citotossicità su RMA T-cell linfoma e RMA-S. Crescita in animali singenici o rigetto

15. I recettori inibitori sono altamente polimorfici e riconoscono determinanti polimorfici sulle molecole MHC di classe I • Esistono tre classi principali di recettori inibitori: • KIR (Killer-cell Ig-like Receptor), NK umane • Ly-49 (lectin-like receptor), NK murine • CD94/NKG2A (eterodimero), NK sia umane che murine

16. Recentemente è stato individuato una nuova classe di recettori inibitori polimorfici: • NKR-P1B and NKR-P1D • (NKR-P1 family, lectin-like type 2 tm receptors) • Riconoscono Ocil (Clr-b) • Ocil stesso è un membro della famiglia delle lectin-like type 2 tm proteins • Ocil è ampiamente espresso su cellule normali ma DOWN-REGOLATO in cells tumorali

17. Qa-1b (murino) e HLA-E (umano): MHC atipici, basso polimorfismo, sequenze leader I recettori inibitori contengono dei domini ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory)capaci di reclutare le fosfatasi SHP-1 e SHP-2. ZAP-70 Blocco trasduzione

18. I Recettori ATTIVATORI: La teoria del MISSING SELFnon sempre è in grado predire correttamente l’attivazione delle cellule NK: cellule che esprimono livelli normali di MHC I possono essere uccise dalle cellule NK, in questo processo sono fondamentali i recettori attivatori delle cellule NK.

19. Le cellule NK non utilizzano un unico recettore attivatorio multipotente, bensì una serie di recettori diversi FcgRIIIa (IgG1,3) ADCC NCR MHC classe I

20. I recettori attivatori mancano di attività intrinseca e si associano a diverse proteine adattatrici: CD28 in T cells ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activating domain pYINM: PI3K binding motif

21. Il recettore attivatorio NKG2D: Cellule che esprimono normali livelli di MHC classe I, MA che esprimono ligandi per NKG2D sono lisate da cells NK

22. I diversi ligandi di NKG2D: • Humans: • MIC -A-B: • MHC I chain related -A e -B (virus/stress) • ULBP: • UL-16 binding protein (virus) • Mice: • Rae1: • Retinoic early transcript 1 • Mult1: • Mouse UL16-bind like transcript (2002) • H60: minor his.complx

23. TLRs e NKG2D: E’ possibile che i TLR modulino l’espressone di NKG2D o che i due recettori cooperino nell’inviare segnali attivatori

24. Sviluppo e selezione delle cellule NK: • Le cellule NK si sviluppano nel midollo osseo. • Meccanismo di selezione: • Le cellule NK esprimono più recettori inibitori che funzionano in modo indipendente • Diverse cellule NK esprimono diversi recettori inibitori • L’aplotipo dell’MHC di classe I influenza il repertorio di cellule NK: le cellule NK hanno recettori inibitori solo per l’MHC cl I presente nell’ambiente di sviluppo • Fenomeno della Hybrid resistance: • Le cellule NK del topo F1 rigettano le cellule ematopoietiche dei genitori Missing Self!!!

25. Padre MHC classe I aplotipo x,y Madre MHC classe I aplotipo z,k NK NK NK Cells selezionate per MHC classe I x,y NK Cells selezionate per MHC classe I z,k NK Figlio MHC classe I aplotipo x,z NK Cells selezionate per MHC classe I x,z Le cells NK del figlio non RICONOSCONO y e k con recettori inibitori, pertanto vedranno “down regolazione” delle molecole MHC di classe I sia sulle cellule paterne (mancano di z) che sulle cellule materne (mancano di x)

26. Espressione di recettori durante lo sviluppo delle cellule NK:

27. Le cellule NK subiscono un processo di selezione. • Ruolo positivo dei recettori inibitori Ly49 • Aumentata proliferazione delle cellule NK se esprimono un recettore inibitorio per una molecola MHC self (selezione positiva) • I recettori utilizzati in periferia per l’inibizione vengono usati a livello midollare per trovare antigeni self che inducano la maturazione funzionale delle cellule NK • Cellule NK che non riconoscono antigeni self (=non hanno recettori inibitori Ly49 per molecole MHC self) non possono svolgere la propria attività (citotossica/IFNgamma) in periferia

28. Risposte immunitarie delle cellule NK: • ATTIVITA’ ANTI-TUMORALE • L’eliminazione delle cellule NK in vivo provoca un aumento della formazione di tumori.

29. Linee tumorali esprimenti i ligandi per NKG2D (MIC-A/-B, ULBP, RAE-1, Mult) sono sensibili alla lisi da parte delle cellule NK indipendentemente dall’espressione delle molecole MHC di classe I. MICA MICB espressi anche da tumori primari di origine epiteliale. B16-BL6 melanoma: NO ligandi per NKG2D--> è una delle linne tumorali maggiormente tumorogenica e non immunogenica

30. ATTIVITA’ ANTI-BATTERICA: • La forte produzione di interferone g da parte delle cellule NK può: • indurre l’attivazione di macrofagi • può favorire la polarizzazione delle cellule T verso una risposta di tipo Th-1 • può portare alla produzione della iNOS con rilascio di NO

31. ATTIVITA’ ANTI-VIRALE: • Ruolo fondamentale nelle risposte contro gli Herpesviruses, in particolare HCMV e MCMV • CMV: • alteraz TAP e espressione MHC • UL18: simile a MHC cl I • UL40: favorisce up regolazione HLA-E • UL16: lega ULBP1,2 MICB

32. Altri virus: virus dell’influenza (NKp46) EBV (CD244, se manca SAP--> morte del paziente)

33. Se le cellule NK hanno un ruolo nell’immunità innata, quali sono i meccanismi precoci che sono coinvolti nel priming di queste cellule?

34. Activation Inhibition NK cells Recettori inibitori specifici per molecole MHC di classe I: NKG2A, KIR, Ly49 • FcgRIIIa (CD16) • Recettori attivatori: NKG2D, • NKp30, NKG2C ?

35. Inhibition Activation Cytokines: IL-15, IL-12, IFNs I, IL-2

36. Relazioni fra cellule NK e Cellule Dendritiche Le cellule NK e le DC vengono richiamate da iDC residenti, macrofagi, cellule endoteliali e neutrofili Le cellule NK fanno rapidamente citolisi (attivata da IFN tipo I) e questa azione viene amplificata dal contatto con iDC che producono IFN type I In seguito al contatto col patogeno , le DC producono numerose citochine fra cui IL-2, IL-12, IL-15 Le cellule NK proliferano Le cellule NK diventano pienamente attivate, producono IFNge hanno attivita citotossica anche nei confronti delle DC f)Le cellule NK possono anche indurre la maturazione delle DC via TNFa g)Le mDC migrano ai linfociti per attivare la risposta immunitaria adattativa

37. Le cellule NK inducono morte o maturazione (TNFa) delle cellule dendritiche??? Dipende dal rapporto NK/DC

38. Ruolo dell’IL-2 nell’attivazione delle cellule NK: L’incubazione delle cellule NK in vitro con rIL-2 causa una loro forte attivazione e permette loro di uccidere cellule prima resistenti. L’ hrIL-2 è utilizzata come farmaco per l’immunoterapia di tumori in pazienti con numerose metastasi. La sua somministrazione in vivo provoca una “super-attivazione” delle cellule NK che diventano LAK (linphokine-activated killer), che possono infiltrare i siti tumorali. A questo processo è inoltre associata una grossa produzione di interferone g.

39. L’IL-2 prodotta nelle fasi iniziali della risposta immunitaria dalle DC può avere un ruolo fondamentale nel processo di attivazione delle cellule NK?

40. + Bacteria (E.Coli DH5a) Immature BMDC NK cells 18h ELISA for IFNg production by NK cells SI’! Attivazione di DC con stimolo batterico: Le DC producono precocemente IL-2 IN VITRO:

41. 1200 bacteria + NK bacteria + NK + anti-IL-2 Ab 1000 bacteria + NK + isotype-ctrl Ab bacteria + NK + rIL-2 800 NK bacteria pg/ml 600 alone 400 200 0 wtBMDC IL-2-/- NK L’IL-2 in vitro è necessaria per indurre l’attivazione delle cellule NK in termini di produzione di interferone g

42. 1200 1000 E.Coli + NK NK + IL-2 800 E.Coli + NK + IL-2 NK pg/ml 600 400 200 0 wtBMDC wtBMDC in transwell L’IL-2 non è sufficiente ad indurre la produzione di interferone g

43. anti-IL-2 + E.Coli isotype isotype + anti-IL-2 not treated E.Coli not treated IN VIVO: L’IL-2 è necessaria per indurre l’attivazione delle cellule NK in termini di produzione di interferone g. Bacteria (E.Coli DH5a) 4h Intracellular staining for IFNg production by NK cells 40 30 20 p<0.05 % IFN high 10 0 E.Coli E.Coli not treated not treated IL-2 -/- Wild type

44. B16 B16 melanoma cells metastatize in the lungs Metastasis growth can be blocked by NK cell-derived IFNg Lung metastasis counting two weeks later RAG-/- Activated wt or IL2-/- DCs 60 40 p<0.05 No. lung metastasis 20 0 Activated Activated IL-2-/-BMDC wtBMDC B16

45. Ruolo IFNg prodotto dalle cellule NK nelle successive risposte dell’immunità adattativa? • E’ stato recentemente visto che: • Cellule NK attivate da cellule che esprimono bassi livelli di MHC classe I sono in grado (grazie alla produzione di IFN gamma) di indurre la produzione di IL-12 da parte delle DC che sono quindi in grado di attivare CTL • Cellule NK sono in grado di indurre la differenziazione delle cellule dendritiche a DC1 in seguito ad attivazione con cellule tumorali e IFN type I

46. CELLULE NK-T • Le cellule NK-T sono una sottopopolazione dei linfociti T esprimente: • Repertorio ab TCR ristretto • Recettori delle cellule NK: NK1.1, DX5, Ly-49 • Markers delle cellule T attivate/memrry: • CD44high, CD69+, CD62L-

47. Le cellule NK-T sono una popolazione disomogenea: Le cellule NK-T umane esprimono la catena Va24 Le cellule NK-T dipendono per lo sviluppo da CD1-d Le cellule NK-T rappresentano il 20-30% dei linfociti epatici

48. Le cellule NK-T ricevono segnali attivatori attraverso il TCR e segnali inibitori attraverso Ly-49 Il TCR riconosce peptidi presentati dalla molecola MHC I non convenzionale CD1d: i ligandi “naturali” delle cellule NK-T non sono noti (micobatterio tubercolosi?), aGalCer è un glicolipide in grado di attivare fortemente le cellule NK-T

49. Una volta attivate dal legame del TCR a CD1d-aGalCer le cellule NK-T: • Hanno attività citolitica diretta o indiretta tramite l’attivazione delle cellule NK • Producono rapidamente, entro poche ore dall’attivazione, grosse quantità di IL-4 e IFNg

50. Sviluppo e selezione delle cellule NK-T: T prima di NK • Le cellule NK-T si sviluppano nel TIMO (CD1d!!!) • Le cellule NK-T sono selezionate positivamente da timociti corticali DP che esprimono CD1d • Caratteri cellule NK-T: selezione da timociti DP? Alta avidità di legame (memory)? • Possibile autoreattività periferica controllata da recettori inibitori cellule NK (Ly-49)