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Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico

Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico. Metti il DNA e le cellule insieme. Fai qualcosa di speciale. Scatola nera. Poi succede qualcosa ……. Trasformazione batterica Uptake of DNA nudo , spesso un plasmide circolare. Cell wall. GFP. Bacterial chromosomal DNA.

Olivia
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Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico

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Presentation Transcript

  1. Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico Metti il DNA e le cellule insieme Fai qualcosa di speciale Scatola nera Poi succede qualcosa …….

  2. Trasformazione battericaUptake of DNA nudo, spesso un plasmide circolare Cell wall GFP Bacterial chromosomal DNA Beta lactamase (ampicillin resistance) pGLO plasmids

  3. Metodi di trasformazione • Elettroporazione • shock elettrico che rende le membrane cellulari permeabili al DNA(si usa anche per le lellule eucariotiche) • Calcio cloruro/Heat Shock • Cellule, rese competenti chimicamente, incorporano DNA nudo dopo heat shock

  4. Ruolo del CaCl2 perrendere le cellule competenti • CaCl2 genera buchi nella membrana dei batteri rendendoli capaci di incorporare DNA

  5. Ca++ O Ca++ O P O Base O O CH2 Sugar O Ca++ O O P Base O O CH2 Sugar OH Ruolo del CaCl2 perrendere le cellule competenti- cont • Gli ioni of Ca+2 carichi positivamente mascherano le cariche negative dei gruppi fosfato presenti nel DNA

  6. Attenzione!!!! • CaCl2 rende le cellule più fragili • Delicatezza (ghiaccio e pipettata gentile)

  7. Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico Metti il DNA e le cellule insieme 45 minuti in ghiaccio Il DNA aderisce ai batteri Shock termico 42 °C per 2 min Il DNA entra nei batteri

  8. Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico - cont Periodo di recupero a 37 °C in presenza di terreno che permette la replicazione del DNA plasmidico nelle cellule in cui è entrato 1 ora a 37 °C Questo periodo permette alle cellule di esprimere il gene di resistenza all’ antibiotico (ampicillina) e di potere replicare successivamente sulle piastre

  9. Controlli della Trasformazione

  10. Spread plate

  11. Spread plate

  12. Spread plate • Piastre rigorosamente asciutte • MAI piastrare più di 300 µl o MENO di 50 µl • Raffreddare bene la bacchetta di vetro • Lasciare asciugare prima di spostare le piastre • Le piastre danno conteggi affidabili solo se il numero di colonie é tra 30 e 500

  13. Finalmente…. Se non avete la disponibilità di un incubatore a 37 °C potete lasciare le piastre sul banco. Vedrete le colonie dopo 2 3 giorni.

  14. EFFICIENZA DI TRASFORMAZIONEColony Forming Unit (CFU)/µg DNA • Calcolre i µg totali di DNA usati • Calcolare il fattore di diluizione della piastratura (se é stata fatta) • Contare le colonie • Moltiplicare il numero di colonie per la diluizione di piastratura • Dividere per i ng di DNA utilizzato • Efficienza di trasformazione (CFU/g)= n°colonie  g DNA

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